常见问题

应用

 

我能在同一个杂交区进行多次 FISH 吗?

是的。请参见顺序 FISH 方案一节。

 

使用 Vysis 直接标记探针(CEP 或 LSI)可以看到的最小 DNA 大小(连续 DNA 序列)是多少?

其大小取决于多种因素;一般来说,大约 3 万个碱基是最小的限制。

 

如何将两个探针混合在一起?

加入 7 µL 杂交缓冲液、1 µL 纯化水、1 µL EACH 探针,总体积为 10 µL

 
 
 
 
滤光片

 

对于 PathVysion、UroVysion 和 AneuVysion,建议使用何种滤光片?

  • PathVysion:(3 滤光片)绿/橙色 v.2、DAPI/9-橙色、绿色单通道滤光片。 
  • UroVysion:(4 滤光片)DAPI、红/绿色、金色、浅绿色。 
  • AneuVysion:(4 滤光片)DAPI/橙/绿、绿色单通道滤光片、橙色单通道滤光片、浅绿色单通道滤光片。 

有关其他产品的滤光片信息,请致电 1-800-553-7042 x2 与 Vysis 技术服务部门联系。

 

哪种类型的光源最适合查看荧光?

建议使用 100 瓦汞灯光源,每 200 小时更换一次。

 

为什么我的荧光信号微弱?

除了使用适当的滤光片外,显微镜激发光源和灯的老化将影响荧光团信号显示的强度。我们建议使用 100 瓦汞灯,使用时间少于 200 小时。一些探针信号与其他探针信号相比更亮或具有不同的形状。例如,LSI® 信号比 CEP® 信号更紧凑,观察者可以将其判断为不太亮的信号。事实上,LSI 的信号只是更小。不同 WCP® 染色体染料具有不同的染色强度,观察者可能将特定 WCP® 染色体染料描述为不像他们使用的前一种那样亮。

 

德州红滤光片可以用来观察 Vysis SpectrumOrange 探针吗?

否。SpectrumOrange 探针需要使用 Vysis SpectrumOrange 滤光片。红光和橙光的波长在光谱中足够接近以使信号可见,但是信号强度不可重现。

 

金色光滤光片可以用来观察 Vysis SpectrumOrange 探针吗?

否。SpectrumOrange 探针需要使用 Vysis SpectrumOrange 滤光片。金色光和橙光的波长在光谱中足够接近以使信号可见,但是信号强度不可重现。

 
 
 
 
概述

 

FDA 许可与 FDA 批准之间有何区别?

FDA 批准是指根据新设备的 PMA(上市前批准)流程批准上市销售的产品。FDA 许可是指在 510 (K) 审查下许可上市销售的设备。一般来说,PMA 流程更加严格,目标是真正的新产品。如果设备在概念上与市场上已有设备相似,或代表对现有产品的改进,可以根据 510(K) 选择 FDA 许可。

 

Vysis 能否就如何报告患者结果提供建议?

否。Vysis 并非临床实验室,无法就如何报告患者结果提供意见。Vysis 也不能提供设备命名的建议。

 

ASR 和 IVD 之间有何区别?

ASR——分析物特异性试剂。ASR 是用于家庭酿造测试的产品,具有制造商 GMP 保证。ASR 必须按照 21 CFR § 809.10(e) 法规要求进行贴标。广告和宣传材料受 21 CFR § 809.30(D) 法规制约。使用 ASR 进行内部试验的实验室应根据 21 CFR § 809.30(e) 的法规要求将本声明附在试验报告后以通知订购人员试验结果:“本试验由(实验室名称)开发并测定其性能特征。尚未经美国 FDA 许可或批准。”ASR 不具有任何预期用途权利要求;实验室负责确定预期用途和截止范围。Vysis ASR 产品示例:LSI® bcr/abl、LSI DiGeorge、TotelVysionIVD、体外诊断使用——经 FDA 许可或批准用于一种或多种特定预期用途的诊断产品,具有既定的分析和临床性能特征。Vysis IVD 产品示例:PathVysion、UroVysion、AneuVysion、CEP® 8 SO、CEP 12 SO、CEP X/Y。

 

小瓶上的批号为什么不同于试剂盒批号?

每个探针附带的分析证书上显示的批号即为试剂盒批号。大多数试剂盒由一小瓶探针和一小瓶杂交缓冲液组成。其他试剂盒含有与杂交缓冲液预混合的探针。每个组成部分都有唯一的部件号和批号(独立于试剂盒的部件号和批号)。从我们的目录订购产品时,您使用的编号是目录编号,而不是试剂盒中小瓶上显示的单个部件号。

 
 
 
 
探针

 

探针的稳定性如何?我能将其冷冻-解冻吗?我可以稀释后储存吗? 

正确储存时,探针是稳定的。探针可以反复冷冻和解冻。如果探针未被稀释后储存,则降解的风险较小。

 

我需要放大信号吗?

不,不需要信号放大。Vysis 直接标记的探针具有明亮的信号而无需任何额外的检测步骤。

 

我可以减少每次测定的探针量吗?

不,信号强度会太弱。

 

直接标记探针和间接标记探针有何区别?

对于直接标记的探针,荧光团共价连接到 DNA 探针上。对于间接标记的探针,半抗原(如生物素或地高辛)被掺杂至探针中。一系列后杂交步骤(“夹心”)使荧光团结合至半抗原。

 

我什么时候使用 WCP 探针和 CEP 探针?

CEP 探针用于间期细胞和中期扩散,并可用于测定倍性(例如三体性 18)。WCP 全染色体染料探针仅用于中期扩散。由于结果难以判读,科学界不推荐在间期细胞上使用。

 

WCP 探针是否与其他人类染色体或啮齿动物染色体交叉反应?

WCP 探针可能与其他人类染色体发生一些交叉反应。探针混合物含有人 Cot-1®* DNA 以减少与靶标和非靶标 DNA 上重复序列的结合。您可以加入更多的人 Cot-1 DNA。一些 WCP 探针由从人/仓鼠杂交体细胞获得的流式分选的人染色体 DNA 文库制备。如果要分析杂交体细胞的人染色体含量,请使用 GIBCO/BRL 仓鼠 Cot1 DNA 或小鼠 Cot1 DNA 作为封闭试剂。

 

如果混合 LSI 和 CEP 探针,使用哪种杂交缓冲液?

使用 LSI 杂交缓冲液。CEP 缓冲液更加严格,LSI 缓冲液较不严格。LSI 需要较不严格的缓冲液,或者可能不与其靶标杂交。并非所有结合 LSI 和 CEP 的配置都已经 Vysis 测试。对于某些探针混合物,由于较低的严格性条件,CEP 探针可能发生与其他染色体的交叉杂交。

 

如何将两个探针混合在一起?

加入 7 µL 杂交缓冲液、1 µL 纯化水、1 µL EACH 探针,总体积为 10 µL

 

为什么我的荧光信号微弱?

除了使用适当的滤光片外,显微镜激发光源和灯的老化将影响荧光团信号显示的强度。我们建议使用 100 瓦汞灯,使用时间少于 200 小时。一些探针信号与其他探针信号相比更亮或具有不同的形状。例如,LSI 信号比 CEP 信号更紧凑,观察者可以将其判断为不太亮的信号。事实上,LSI 的信号只是更小。不同 WCP 染色体染料具有不同的染色强度,观察者可能将特定 WCP 染色体染料描述为不像他们使用的前一种那样亮。与间接标记探针的一些放大信号相比,来自直接标记探针的信号可能被一些观察者描述为微弱。Vysis 探针信号可能看起来较小,但信号却很明亮。此外,由于缺乏背景荧光,该信号更容易被视为真实信号并加以区分。

 
 
 
 
样品制备

 

在进行 FISH 前,应该如何观察玻片(含有中期制备物)?

在相差显微镜下评估玻片制备物。

  • 良好的制备:染色体和细胞核应为暗灰色、不可分裂、细胞质极少。
  • 较差的制备:细胞将表现为“相亮”,呈现白色,细胞核周围有光晕。可能的原因:玻片上的样本在制备过程中可能干燥过快。解决方法:
    • 将样本放在 65°C 水浴的架子上 20 分钟,在“滴下”样本时增加玻片周围的湿度。
    • 请勿烘烤玻片;烘烤玻片会对杂交结果产生不利影响。
    • 在室温下将玻片干燥过夜。玻片在室温下老化过夜时可获得最佳结果。
  • 在同一天制备和使用的玻片并非最佳,但是可以使用以下步骤在一天内制备玻片:首先在 45°C 玻片加热器上干燥玻片 30 分钟,然后在目标 DNA 变性之前在 70%、85% 和 100% 乙醇溶液中分别将玻片脱水 1 分钟(用于 FISH 的步骤 1)。

 

FISH 后,得到一个昏暗的信号和一层覆盖玻片的“薄雾”。我该如何纠正这种情况?

通常原因是掉落到玻片上的细胞密度过高。薄雾来自细胞质。尝试用新鲜固定剂洗涤细胞沉淀,稀释样本并滴在新玻片上。某些类型的样本(接触式制备物、骨髓或血液涂片、石蜡包埋样本)可能更容易出现“薄雾”问题。这些类型的样本可能需要额外的处理:

  • 涂片:在 70% 乙酸中洗涤 30 秒,风干,在 100% 甲醇中洗涤 30 秒。
  • 石蜡包埋样本:增加蛋白质消化时间。

 

为什么复染剂颜色很淡?

玻片在施加复染剂之前可能没有适当地干燥。滴下细胞后,务必使玻片老化 24 小时。试着用系列乙醇洗涤液对样本脱水,然后重新复染。此外,请确保您有适当的滤光片来观察复染。Vysis 提供了两种浓度的 DAPI 复染剂。DAPI II (125 ng/mL) 适用于 CEP® 和 LSI® 探针,是 DAPI I (1000 ng/mL) 的八倍稀释物;DAPI I 适用于 WCP® 染色体染料。将 DAPI II 与 WCP 探针一起使用可能会产生过于微弱的复染。

 

为什么样本的细胞形态扭曲了?

不同的组织或样本类型可能需要不同的变性时间。如果样本类型的变性时间过长,细胞将出现扭曲。尝试以四分钟变性时间开始,然后相应地调整。

 

我可以将制备好的玻片储存多长时间,并且仍能有效地进行杂交?

如果玻片在氮气下保持在 -20°C,则至少在 6 个月内可用。

 

杂交后,可以将玻片保存多长时间,还能看到荧光?

如果玻片储存在 -20°C 下,且并非经常暴露于汞灯的高强度紫外光下,则能够持续使用数月。信号将随着时间和曝光而衰减。

 

我可以在 G 带中期扩散后进行 FISH 吗?

是,以下参考文献包含此流程:

 

JalalSM, Law ME, Christensen ER, Spurbeck JL, Dewald GW.Method forsequential staining of GTLbanded metaphases with fluorescentlabeledchromosome specific paint probes.Am J Med Genet 46:98103, 1993.

 
 
 
 
试剂

 

为什么 Vysis 程序不要求在 FISH 测定中添加抗荧光衰减剂?

Vysis 复染剂、DAPI I 复染剂、DAPI II 复染剂、碘化丙锭复染剂均在溶液中含有抗荧光衰减剂。

 

加热时,含有 0.1% NP-40 的清洗液变浑浊。出了什么问题?

这是正常的。浑浊的外观正常,不会妨碍清洗。

 

DAPI I 和 DAPI II 之间有何区别?

DAPI I 为 1000 ng/mL,约为 DAPI II (125 ng/mL) 浓度的 8 倍。浓度较高的 DAPI I 与 WCP® 染色体染料配合使用性能良好,为中期染色体提供了明亮的可视复染。浓度较低的 DAPI II 用于 CEP® 和 LSI® 探针,具有更紧凑的信号,可被过多的 DAPI 核 DNA 复染所淹没。

 

石蜡预处理试剂盒 I、II 和 III 之间有何区别?

石蜡预处理试剂盒 I 应与 PathVysion® Her-2 neu 组织样本配合使用。后者经 FDA 批准与该试剂盒配合使用,是比试剂盒 II 更耗时(多出约一小时)的预处理。石蜡预处理试剂盒 II 是用于石蜡切片而非 PathVysion Her-2 和前列腺组织的耗时较短预处理方案。石蜡预处理试剂盒 III 是一种更严格的方案,应用于前列腺组织或疑难标本的疑难解答。该试剂盒含有蛋白酶 K 而非胃蛋白酶。

 

杂交缓冲液由哪些成分组成?

  • CEP 杂交缓冲液:55% 甲酰胺、1XSSC、10% 硫酸葡聚糖
  • LSI/WCP 杂交缓冲液:50% 甲酰胺、2XSSC、10% 硫酸葡聚糖
 
 
 
 

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