ToTelVysion TM:多色 DNA FISH 探针混合物

ToTelVysionTM:多色 DNA FISH 探针混合物

共变性前的样本预处理。

 

强烈建议在中期玻片制备物上进行 ToTelVysion 探针杂交前实施以下预处理程序。该方法的目的是使染色体 DNA 可用于杂交,并保护染色体的形态不受共变性过程的影响。

  1. 将样本玻片在含有 2X SSC 溶液的 Coplin 染色缸中于 73 ℃ 孵育 2 分钟。 
  2. 将玻片在含有蛋白酶/胃蛋白酶溶液的Coplin 染色缸中于 37 ℃ 孵育 10 分钟。 
  3. 将玻片在含有 PBS 的 Coplin 染色缸中于室温洗涤 5 分钟。 
  4. 将玻片放入含有甲醛溶液的 Coplin 染色缸中于室温放置 5 分钟。 
  5. 从甲醛溶液中取出玻片,在含有 PBS 的 Coplin 染色缸中于室温下洗涤 5 分钟。 
  6. 玻片在 70% 乙醇中脱水 1 分钟,然后在 85% 乙醇中脱水 1 分钟,在 100% 乙醇中脱水 1 分钟。 
  7. 风干玻片。

 

ToTelVysion 多色 DNA FISH 探针混合物由总共 62 种 DNA FISH 探针组成。

 

 
组分 ToTelVysion 多色 DNA 探针
数量 30 µL x 15 瓶含有多种探针的混合物
成分 荧光团标记的 TelVysion、CEP® 和 LSI® 探针,混合有含硫酸葡聚糖、甲酰胺和 SSC (pH 7.0) 杂交缓冲液的 DNA 封闭液
储存 -20°C 避光保存 
 
 
TOTELVYSION 小瓶编号 探针混合物说明
混合物 1 TelVysion 1p SpectrumGreen、TelVysion 1q SpectrumOrange、TelVysion Xp/Yp SpectrumOrange 和 SpectrumGreen、CEP X SpectrumAqua
混合物 2 TelVysion 2p SpectrumGreen、TelVysion 2q SpectrumOrange、TelVysion Xq/Yq SpectrumOrange 和 SpectrumGreen、CEP X SpectrumAqua
混合物 3

TelVysion 3p SpectrumGreen、TelVysion 3q SpectrumOrange、TelVysion 22q SpectrumOrange 和 SpectrumGreen、LSI bcr (22q11) SpectrumAqua

混合物 4 TelVysion 4p SpectrumGreen、TelVysion 4q SpectrumOrange、TelVysion 21q SpectrumOrange 和 SpectrumGreen、LSI AML (21q22) SpectrumAqua
混合物 5 TelVysion 5p SpectrumGreen、TelVysion 5q SpectrumOrange 
混合物 6 TelVysion 6p SpectrumGreen、TelVysion 6q SpectrumOrange、TelVysion 13q SpectrumOrange 和 SpectrumGreen、LSI 13 (13q14) SpectrumAqua
混合物 7 TelVysion 7p SpectrumGreen、TelVysion 7q SpectrumOrange、TelVysion 14q SpectrumOrange 和 SpectrumGreen、LSI TCR (14q11.2) SpectrumAqua
混合物 8 TelVysion 8p SpectrumGreen、TelVysion 8q SpectrumOrange、TelVysion 17p SpectrumOrange 和 SpectrumGreen、CEP 17 SpectrumAqua
混合物 9 TelVysion 9p SpectrumGreen、TelVysion 9q SpectrumOrange、TelVysion 17q SpectrumOrange 和 SpectrumGreen、CEP 17 SpectrumAqua
混合物 10 TelVysion 10p SpectrumGreen、TelVysion 10q SpectrumOrange、TelVysion 15q SpectrumOrange 和 SpectrumGreen、LSI PML (15q22) SpectrumAqua
混合物 11 TelVysion 11p SpectrumGreen、TelVysion 11q SpectrumOrange、TelVysion 18p SpectrumOrange 和 SpectrumGreen、CEP 18 SpectrumAqua
混合物 12 TelVysion 12p SpectrumGreen、TelVysion 12q SpectrumOrange、TelVysion 18q SpectrumOrange 和 SpectrumGreen、CEP 18 SpectrumAqua
混合物 13 TelVysion 16p SpectrumGreen、TelVysion 16q SpectrumOrange
混合物 14 TelVysion 19p SpectrumGreen、TelVysion 19q SpectrumOrange、LSI 19p13 SpectrumAqua
混合物 15 TelVysion 20p SpectrumGreen、TelVysion 20q SpectrumOrange 

 

 

所需但未提供的材料

  • 12N 盐酸(用于调节洗涤液的 pH 值) 
  • 1 N Na OH(用于调节洗涤液的 pH 值) 
  • Coplin 染色缸
  • 经过校准的温度计 
  • 镊子 
  • 量筒 (100 - 1000 mL)
  • 磁力搅拌器 
  • 100% 乙醇 
  • 微量离心机 
  • 微升级移液器吸头(体积为 1 - 10 µl) 
  • 微升级移液器(体积为 1 - 10 µl) 
  • pH 计 
  • 预清洁的玻璃显微镜载玻片 
  • 纯化水(蒸馏水或去离子水) 
  • 定时器 
  • 涡旋混合器 
  • 水浴(37°C 和 73°C)
  • 荧光显微镜 
  • 37°C 培养箱 
  • 20X 标准柠檬酸钠 (SSC)、500 g(列表编号 02J10-032)NP-40、4000 µl (列表编号 07J05-001;数量 2)
  • 甲酰胺(超纯级) 
  • DAPI II 复染剂 
  • 玻片加热器 (45 - 50°C) 
  • 荧光显微镜浸镜油 
  • 橡胶胶水 
  • 盖玻片(12 mm 圆形)
  • 金刚石头划线器
  • 一次性注射器
  • pH 试纸
  • 0.45 uM 过滤器
  • 加湿室
  • 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 
  • 10% 中性缓冲福尔马林 
  • 2M 氯化镁 (MgCl2) 
  • 蛋白酶/胃蛋白酶

 

制备标本靶标

为了使所有 15 种 ToTelVysion 混合液杂交,使用至少 3 个标本玻片,每个玻片划出 5 个划刻靶区,共 15 个靶标区域。

 

totelvysion-multi-color-dna-fish-probe-mixtures-slide.gif

包含靶标 1、2、3、4 和 5 的玻片 1 的示例对玻片 2 和 3 重复相同类型的靶标组织,每个玻片上 5 个靶标。

 

 
 
 
 
探针制备

制备探针并将探针混合物加入到样本玻片中

  1. 将每个 ToTelVysion 探针混合物预混合并在杂交缓冲液中制备。从 -20°C (±5°C) 取出小瓶。室温下解冻。 
  2. 将每个解冻的探针混合物小瓶在微量离心机中离心 1 - 3 秒。 
  3. 涡旋然后再次短暂离心。 
  4. 使用微量移液器从小瓶中取出 3 µL 探针,并放入微量离心管中。以相同的方式在 15 个小瓶的每一个中制备探针。 
  5. 将每个装有 3 µL 探针的微量离心管置于 73 ± 1°C 水浴中 5 分钟,使探针变性。 
  6. 从水浴中取出离心管。 
  7. 将试管放置在 45 - 50°C 的玻片加热器上,直到准备好将探针应用于靶标 DNA。

注意:当探针变性时,如果玻片准备就绪,可以立即将探针应用于靶标 DNA。 

 

将探针与标本靶标杂交

注意:准备加湿箱时,将蘸有水的纸巾放在密闭容器的一侧。 

  1. 从 100% 乙醇中取出玻片。 
  2. 通过将玻片的底部边缘接触吸水纸并使用纸巾擦拭玻片的下侧来干燥玻片。 
  3. 将玻片置于 45 - 50°C 玻片加热器上,持续 2 分钟,蒸发剩余乙醇。 
  4. 将 3 µL 探针混合物滴加到 1 个靶标区域,并立即盖上 12 mm 圆形盖玻片。对其他 14 个靶标区域重复上述步骤。

注意:不允许每个靶标区域的盖玻片相互接触。如果接触,盖玻片之间的毛细管作用将导致探针从一个靶标移动到另一个靶标。

 

5.用橡胶胶水密封每个盖玻片,确保橡胶胶水与盖玻片边缘重叠,以在盖玻片和载玻片表面之间形成紧密密封。 

 

6.将玻片放入预热的加湿箱中,并于 37°C 培养箱中放置 12 - 24 小时。 

 

洗涤玻片

配制洗涤溶液:

注意:开始洗涤程序前,将溶液置于适当温度。

  • 将 70 mL 0.4X SSC/0.3% NP - 40 倒入 Coplin 染色缸中。使用前,将染色缸置于 73 ± 1°C 水浴中至少 30 分钟。使用 1 天,然后弃置。
  • 将 70 mL 2X SSC/0.1% NP - 40 倒入 Coplin 染色缸中。室温下使用。使用 1 天,然后弃置。

注意:要维持 0.4X SSC/0.3% NP-40 适当的温度,请同时洗涤 4 张玻片。如果少于 4 张玻片,请加入室温下的空白玻片,使总数达到 4 张。

 

 7.  从载玻片上取下盖玻片,立即将玻片浸没于 73 ± 1°C 的 0.4X SSC/0.3% NP-40 中。振荡玻片 1 - 3 秒。对其他玻片重复此步骤。  

 

8.   2 分钟后取出玻片。

 

9.  将玻片浸没于室温下的 2X SSC/0.1% NP-40 中。振荡玻片 1 - 3 秒。30 秒至 2 分钟后取出玻片 

 

杂交可视化

  1. 在黑暗处风干玻片。
  2. 滴加 3 µL 的 DAPI II 复染液至每个玻片的靶标区域,然后盖上 12 mm 圆形盖玻片。或者滴加 10 µL 的 DAPI II 复染液至每个玻片的半边区域,然后在复染液上盖上 22 x 50 mm 盖玻片。轻轻按压盖玻片顶部,以去除多余的 DAPI。用纸巾吸干。 

设置 ThermoBrite 参数

立即将每个玻片(使用探针和盖玻片)放置到 ThermoBrite 的表面板上。用水湿润湿度条并放入盖子中。

  1. 用橡胶胶水密封每个盖玻片,确保橡胶胶水与盖玻片边缘重叠,以在盖玻片和载玻片表面之间形成紧密密封。
  2. 对于培养的淋巴细胞和羊水细胞,将变性温度设置为 70 ℃,变性时间设置为 3 分钟。(注意:这些温度可能需要根据样本类型进行调整。请参阅 ThermoBrite 操作员手册 (55-005322)。)
  3. 将杂交温度设置为 37 °C,杂交时间设置为过夜(12 - 16 小时)。
  4. 杂交时间结束后,使用前述快速洗涤程序洗涤玻片。
  5. 在黑暗处风干玻片。
  6. 滴加 3 µL 的 DAPI II 复染液至每个玻片的靶标区域,然后盖上 12 mm 圆形盖玻片。
 
 
 
 

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