石蜡样本预处理

石蜡切片的样本玻片已预先制备好并在 56° C 烘烤。您需要继续执行预处理方案的其余部分,然后与 Her-2/neu / CEP® 17 探针进行杂交。

 

将玻片脱蜡

Hemo-De 是一种无毒溶剂,具有与二甲苯类似的性质,用于溶解石蜡。乙醇能使样本脱水并溶解残留的石蜡,因此适用于预处理。

____ 1.在室温下将玻片浸入 Hemo-De 中 10 分钟。

____ 2.重复两次,每次使用新的 Hemo-De。

____ 3.将玻片置于室温下的 100% 无水乙醇中脱水 5 分钟。

____ 4.重复步骤 3。

____ 5.风干玻片或者将玻片置于 45 - 50°C 的玻片加热器中 2 - 5 分钟。

 

预处理玻片

HCl 有助于溶解碱性核蛋白,从而使探针更易接触到 DNA。HCl 还用于提取细胞外基质蛋白,这会限制探针对细胞的可及性并导致组织自发荧光。预处理缓冲液有助于蛋白质变性和去除蛋白质之间的交联。这对于允许充分的蛋白酶消化十分重要。

____ 1.将玻片浸入 0.2N 盐酸中 20 分钟。

____ 2.将玻片浸入纯化水中 3 分钟。

____ 3.将玻片浸入洗涤缓冲液中 3 分钟。

____ 4.将玻片浸入 80°C 的预处理溶液中 30 分钟。

____ 5.将玻片浸入纯化水中 1 分钟。

____ 6.将玻片浸入洗涤缓冲液中 5 分钟。使用装有洗涤缓冲液的第二个染色缸重复。 

 

用蛋白酶处理玻片

蛋白酶能消化组织蛋白质,并且对于探针对靶标 DNA 的可及性是必不可少的。

____ 1.从第二缸洗涤缓冲液中取出玻片,并将玻片边缘按在纸巾上以去除多余的缓冲液。

____ 2.将玻片浸入 37°C 的蛋白酶溶液中 10 分钟。

____ 3.将玻片浸入洗涤缓冲液中 5 分钟。使用装有洗涤缓冲液的第二个染色缸重复。

____ 4.将玻片置于 45-50°C 的玻片加热器上 2-5 分钟以使其干燥。

 

固定样本

样本固定可确保在变性和杂交时的组织损失尽可能最小。

____ 1.将玻片浸入室温下 10% 缓冲福尔马林溶液中 10 分钟。

____ 2.将玻片浸入洗涤缓冲液中 5 分钟。使用装有洗涤缓冲液的第二个染色缸重复。

____ 3.将玻片置于 45-50°C 的玻片加热器上 2-5 分钟以使其干燥。继续执行 Vysis LSI® 探针实验方案。

 

使样本变性

____ 1.将玻片浸入预热的 72°± 1°C(<6 片/缸)变性溶液中 6 分钟。

____ 2.在 70%、85% 和 100% 无水乙醇中脱水,各 1 分钟。

____ 3.置于 45-50°C 的玻片加热器上 2-5 分钟以使其干燥。

 

杂交

____ 1.将探针预热至室温,涡旋并旋转沉降。

____ 2.在载玻片的样品区域添加 10 ml 探针混合物。

____ 3.加盖 22x22 mm 盖玻片并用橡胶粘合剂将其边缘密封。

____ 4.将玻片置于预热的、有密封盖的加湿盒中,并放入 37°C 孵育箱中过夜(14-18 小时)。

 

杂交后洗涤

____ 1.将后杂交洗涤缓冲液分别添加到两个 Coplin 染色缸。将其中一个缸在 72±1°C 的水浴中预热,另一个置于室温下。

____ 2.用镊子轻轻地拉扯密封胶以便从玻片上取下橡胶粘合剂密封。

____ 3.在室温下将玻片浸入后杂交洗涤缓冲液中,并使盖玻片漂开。

____ 4.从载玻片边缘吸除多余的液体,并将载玻片浸入 72±1° C 的后杂交洗涤缓冲液中 2 分钟(£6 张载玻片/缸)。

____ 5.从洗涤缓冲液中取出载玻片,在黑暗中竖直风干。

 

复染剂和玻片存放

____ 1.将 10 µL DAPI 复染剂置于载玻片的目标区域,并加盖一张盖玻片。在信号计数之前将玻片储存于黑暗中。或者在下一步中储存。

____ 2.将杂交过的载玻片(带有盖玻片)储存在 -20°C 的黑暗中。从 -20°C 储存中取出后,在使用荧光显微镜观察前,应让玻片恢复到室温。

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