石蜡预处理 2

简短版方案不应替代试剂盒说明书。

预期用途

制备固定在带正电荷载玻片上的石蜡包埋组织切片,以用于采用 Vysis 多色 DNA FISH 探针的荧光原位杂交 (FISH)。

概要和原则

使用 Vysis 多色 DNA FISH 探针进行 FISH 时,设计采用以下程序使组织渗透性最大。

试剂盒中提供的试剂    试剂盒订购号 32-801210    供实验室使用

试剂 数量 成分 储存
预处理溶液 5 x 50 mL 硫氰酸钠 (NaSCN) 2 至 25°C
蛋白酶缓冲液 II 5 x 62.5 mL 0.2 N HCl,pH 1.0 2 至 25°C
蛋白酶 5 x 250 毫克 2500 - 3000 U/毫克蛋白酶,冻干粉 -20 - 8 °C

所需但未提供的材料

  • 无水乙醇 (EtOH)
  • Hemo-De 清除试剂(Scientific Safety Solvents 目录编号HD-150)
  • 纯化水(蒸馏水或去离子水)
  • Coplin 染色缸(16 张玻片/8 槽容量)
  • 37 °C 和 80 °C 水浴(一个置于 73°C 以供探针测定)

 

样本玻片制备

注意:使用福尔马林固定了 24-48 小时的样本。

  1. 用切片机切取 4-5 µm 厚的石蜡切片。
  2. 将切片漂浮于 40ºC 的纯化水(即三蒸水)的水浴中。
  3. 在带正电荷的载玻片上固定切片。
  4. 风干玻片。
  5. 将玻片在 56ºC 的温度下烘烤过夜。

 

将玻片脱蜡

  1. 将玻片浸入室温下的 Hemo-De 中 5 分钟。
  2. 重复步骤一 (1) 两次,每次均使用新鲜的 Hemo-De。
  3. 将玻片置于室温下的 100% 无水乙醇中脱水 1 分钟。重复。
  4. 如果需要,将玻片风干 2-5 分钟。

 

玻片预处理

  1. 将玻片浸入 80ºC 的预处理溶液中 10 分钟。如有必要,可在 Coplin 染色缸的每个槽中背靠背放置两张玻片,两端的槽中放置一张玻片。对于两端的玻片,带有组织部分的玻片一侧必须朝向染色缸的中心。
  2. 将玻片浸入纯化水中 3 分钟。

 

蛋白酶预处理

  1. 将玻片从装有纯化水的染色缸中取出。
  2. 用纸巾吸干玻片边缘,以去除多余水分。
  3. 将玻片浸入 37ºC 的蛋白酶溶液中 15 分钟。加入 250 毫克(1 管)蛋白酶前,确保缓冲液的温度为 37 ± 1ºC。如有必要,可在 Coplin 染色缸的每个槽中背靠背放置两张玻片,两端的槽中放置一张玻片。对于两端的玻片,带有组织部分的玻片一侧必须朝向染色缸的中心。
  4. 将玻片浸入纯化水中 3 分钟。
  5.  将玻片风干 2-5 分钟。

 

固定样品

注意:将样本进行固定以使样本变性期间的组织损失最小。当以变性剂浴形式处理样本时,强烈建议使用此程序。

  1. 向一 (1) 个 Coplin 染色缸中注入 50 mL 10% 缓冲福尔马林溶液。向三 (3) 个 Coplin 染色缸中分别注入 50 mL 70% 乙醇、85% 乙醇和 100% 乙醇。
  2. 将玻片浸入室温下 10% 缓冲福尔马林溶液中 10 分钟。
  3. 将玻片浸入纯化水中 3 分钟。
  4. 风干玻片。
  5. 随后按照相应的 Vysis 探针方案继续进行。

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