淋巴细胞制备:制备培养物

淋巴细胞制备:制备培养物
  1. 将 8-10 mL 外周血吸入一支含有肝素钠防腐剂的 10 mL 绿盖 Vacutainer 管中。充分混合。
  2. 将 Vacutainer 管的内容物无菌转移至一支 15 mL 离心管中。
  3. 在台式离心机中将样品以 2000 rpm 离心 10 分钟。
  4. 使用巴斯德移液管小心地移除血浆层。按照您实验室的生物材料弃置处理程序丢弃血浆层。
  5. 移除血沉棕黄层,即轻轻地围该层旋转,同时将白细胞吸入巴斯德移液管中。一些红细胞和血浆也会被吸入;请尽量减少吸入的红细胞数量。
  6. 将血沉棕黄层排入一支含有 1.5 mL cRPMI 的 15 mL 离心管中。
  7. 将适量的白细胞悬液等分至含有 10 mL cRPMI 的 25 平方厘米培养瓶中。 
  8. 向每个培养瓶中加入 0.2 mL 的 PHA;拧紧盖子,然后稍微拧松以允许 CO2 进入培养瓶。
  9. 孵育培养物:

用于 FISH 玻片制备 ...

此方法产生的染色体带分辨率为 400-450,足以满足大多数 FISH 应用的需求。 

    • 在 37±1 °C、5% CO2 的环境中孵育培养物 72-96 小时。

用于 CGH 玻片制备 ...

这些额外的步骤能提高染色体伸长率和有丝分裂指数。对于 CGH,染色体应该具有 400-550 的带分辨率。

    • 在 37±1 °C、5% CO2 的环境中孵育培养物 48-72 小时。
    • 向每个培养瓶中加入 0.2 mL 胸腺嘧啶溶液并轻轻混合。
    • 孵育培养物 14-18 小时。
    • 将培养物转移至一支 15 mL 离心管中。
    • 以 1000 rpm 离心 10 分钟。
    • 倒掉上清液并加入 10 mL PBS。
    • 以 1000 rpm 离心 10 分钟。
    • 倒掉上清液并向每支管中加入 10 mL cRPMI。
    • 孵育培养物 4-5 小时。
 
 
 
 
收获培养物
  1. 将 8-10 mL 外周血吸入一支含有肝素钠防腐剂的 10 mL 绿盖 Vacutainer 管中。充分混合。
  2. 将 Vacutainer 管的内容物无菌转移至一支 15 mL 离心管中。
  3. 在台式离心机中将样品以 2000 rpm 离心 10 分钟。
  4. 使用巴斯德移液管小心地移除血浆层。按照您实验室的生物材料弃置处理程序丢弃血浆层。
  5. 移除血沉棕黄层,即轻轻地围该层旋转,同时将白细胞吸入巴斯德移液管中。一些红细胞和血浆也会被吸入;请尽量减少吸入的红细胞数量。
  6. 将血沉棕黄层排入一支含有 1.5 mL cRPMI 的 15 mL 离心管中。
  7. 将适量的白细胞悬液等分至含有 10 mL cRPMI 的 25 平方厘米培养瓶中。
  8. 向每个培养瓶中加入 0.2 mL 的 PHA;拧紧盖子,然后稍微拧松以允许 CO2 进入培养瓶。
  9. 孵育培养物:

用于 FISH 玻片制备 ...

此方法产生的染色体带分辨率为 400-450,足以满足大多数 FISH 应用的需求。 

    • 在 37±1 °C、5% CO2 的环境中孵育培养物 72-96 小时。

用于 CGH 玻片制备 ... 

这些额外的步骤能提高染色体伸长率和有丝分裂指数。对于 CGH,染色体应该具有 400-550 的带分辨率。

    • 在 37±1 °C、5% CO2 的环境中孵育培养物 48-72 小时。
    • 向每个培养瓶中加入 0.2 mL 胸腺嘧啶溶液并轻轻混合。
    • 孵育培养物 14-18 小时。
    • 将培养物转移至一支 15 mL 离心管中。
    • 以 1000 rpm 离心 10 分钟。
    • 倒掉上清液并加入 10 mL PBS。
    • 以 1000 rpm 离心 10 分钟。
    • 倒掉上清液并向每支管中加入 10 mL cRPMI。
    • 孵育培养物 4-5 小时。 
 
 
 
 
固定样品
  1. 沿每支离心管的内壁缓慢加入 2 mL Carnoy 固定剂。
  2. 轻轻敲击离心管以将细胞沉淀悬浮液与固定剂混合。
  3. 向每支管内再缓慢加入 6 mL Carnoy 固定剂。
  4. 紧盖每支管并翻转数次以混合。 
  5. 让悬浮液在室温下静置 5 分钟,然后以 1000 rpm 离心 10 分钟。
  6. 将上清液吸出至离心管上的 1.5 mL 标记处,注意避免碰到细胞沉淀
  7. 轻轻敲击离心管以使沉淀与管壁分离。
  8. 执行以下步骤三次:
    • 向每支离心管内缓慢加入 10 mL Carnoy 固定剂。
    • 紧盖每支管并翻转以混合。 
    • 将悬浮液以 1000 rpm 离心 10 分钟。
    • 将上清液吸出至离心管上的 1.5 mL 标记处,注意避免碰到细胞沉淀。
    • 轻轻敲击离心管以使沉淀与管壁分离。
  9. 向每份悬浮液中缓慢加入 Carnoy 固定剂以产生略微混浊的悬浮液并轻轻混合。

 

注意:请您向细胞沉淀中添加固定剂,直至悬浮液略微浑浊;所需固定剂的量取决于细胞沉淀的大小。 

 

细胞可以在 4 °C 下贮存于盖紧的离心管中,直到准备使用。如果玻片不能在 7 天内制备好,请将总体积调至 10 mL 并在 -20 °C 下贮存。在制备玻片之前,将步骤 8a-8e 中描述的洗涤重复两次。

 
 
 
 

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