LSI(位点特异性标识):关键产品信息

LSI(位点特异性标识):关键产品信息

 

1.探针制备

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  • 在室温下混合 7 µL CEP 杂交缓冲液、1 µL CEP DNA 探针和 2 µL 纯化水。*
  • 离心 1-3 秒,涡旋混合,然后重新离心。
  • 在 73°C 水浴中加热 5 分钟。
  • 置于设置为 45-50°C 的载玻片加热器上。

 

2.玻片制备

  • 用金刚石尖划线器标记杂交区域。vysis-lsi-key-product-information-step-2.gif
  • 将载玻片浸入 73+/-1°C 变性剂浴(70% 甲酰胺/2X SSC)中 5 分钟。如果中期染色体形态有问题,70-73°C 的变性剂温度可能会提供更好的结果。
  • 将载玻片置于 70% 无水乙醇中 1 分钟、85% 无水乙醇中 1 分钟以及 100% 无水乙醇中 1 分钟进行脱水。
  • 使载玻片干燥并将其置于 45-50°C 的载玻片加热器上不超过 2 分钟。

 

3.杂交

  • 将 10 µL 探针混合物置于载玻片上。在将探针置于载玻片上 lsi-key-product-information-step-3.gif之后立即放上盖玻片,并用稀释的橡胶粘合剂密封盖玻片。
  • 将载玻片置于预热的加湿箱中,并放入 37°C 孵育箱中过夜 12-16 小时以便进行杂交。
  • 准备一个盛有 0.4X SSC/0.3% NP-40 的洗涤槽,并将其置于 73+/-1°C 的水浴中至少 30 分钟。使用 1 天后丢弃。在室温下准备盛有 2X SSC/0.1% NP-40 的第二个槽。
  • 取下橡胶粘合剂密封和盖玻片,并立即放入洗涤槽 (0.4X SSC/0.3% NP-40) 中,搅动载玻片 1-3 秒。重复处理最多四张载玻片,然后将所有载玻片留在 Coplin 染色缸中 2 分钟。请勿在将任一载玻片置入洗涤浴前一同取下数张载玻片的盖玻片。在最后一张载玻片被添加到洗涤浴中后,开始对孵育计时。
  • 在室温下将载玻片在 2X SSC/0.1% NP-40 中洗涤 5 秒至 1 分钟,当载玻片置于洗涤浴中时搅动 1-3 秒。
  • 使载玻片在黑暗中风干。

 

 

4.解读

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  • 将 10 µL DAPI II 复染剂置于载玻片的目标区域,并加上盖玻片。
  • 使用合适的滤光片组查看玻片。

 

 

 

5.存放

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  • 在 -20°C 黑暗中存放载玻片。
 
 
 
 
LSI 程序备注

 

荧光团容易因曝光而发生光褪色。为了限制这种降解,请在暗光下处理所有含有荧光团的溶液,包括处理杂交载玻片时所涉及的那些步骤。请在黑暗中执行所有不需要在光照下进行操作的步骤(孵育期、洗涤等)。

 

强烈建议使用经过校准的温度计来测量溶液的温度。 

 

在打开每瓶试剂之前,建议使用标准台式微型离心机离心 2-3 秒。

 

在使用前约 30 分钟,将含有变性剂溶液的室温 Coplin 染色缸置于 73°C 水浴中。

 

如果对四张以上的载玻片进行了杂交,则不得于同一批次对它们进行洗涤。在洗涤每个批次之前,洗涤溶液的温度必须恢复到 73+/-1°C。

 

 
 
 
 
LSI 工作试剂制备

 

20X SSC(制备 500 mL 20X SSC,pH 5.3) 

将 132g 20X SSC 加入 400 mL 水中并充分混合。在室温下借助 pH 计使用浓 HCl 将 pH 值调节至 5.3,并将最终体积调整至 500 mL。通过 0.45 微米孔径过滤装置进行过滤。在室温下可贮存不超过六个月。

 

2X SSC/0.1% NP-40(制备 1 升)

将 100 mL 20X SSC (pH 5.3) 添加至 850 mL 纯化水中。添加 1.0 mL NP-40。借助 pH 计使用 NaOH 将 pH 值调节至 7.0-7.5。添加水,使溶液的最终体积达到 1 升。在室温下可贮存不超过六个月。  

 

0.4X SSC/0.3% NP-40 洗涤溶液

将 20 mL 20X SSC 与 950 mL 纯化水充分混合。添加 3 mL NP-40。充分混合,直至 NP-40 溶解。使用 NaOH 将 pH 值调节至 7.0 - 7.5。添加纯化水,使最终体积达到 1 L。在室温下贮存。在 6 个月后丢弃储备溶液,或者在溶液出现浑浊或受污染时丢弃溶液。

 

在室温下可贮存不超过六个月。



变性溶液(制备 70 mL)

将 49 mL 甲酰胺、7 mL 20X SSC (pH 5.3) 和 14 mL 纯化水添加至一个玻璃 Coplin 染色缸中并充分混合。在室温下使用 pH 计测量 pH 值以确认 pH 值介于 7.0-8.0 之间。每个批次的变性剂可使用七天,然后丢弃。在使用周期之间,在 4°C 温度下贮存。

 

乙醇洗涤溶液 

最终浓度为 70%、85% 和 100%。用水制备 100% 乙醇的体积比稀释溶液。稀释溶液最长可使用七天,然后丢弃。如果溶液蒸发或稀释,请更换为新的溶液。在使用周期之间,在室温下贮存。

 
 
 
 

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