滤光片和显微镜基础知识

滤光片和显微镜基础知识

Abbott Molecular 不断扩大的单、双和三带通滤光片组产品系列可生成 Abbott Molecular 试剂的界限清晰的高对比度成像。通过允许同时查看多达五种不同的荧光团,多带通滤光片组提高了荧光原位杂交 (FISH) 程序的实用性,使我们能够从单次测定中同时获得多个结果。每个滤光片组均经过设计和优化以便与 Abbott Molecular 荧光团一起使用。Abbott Molecular 滤光片组适用于大多数常见的显微镜型号,包括:

  • Olympus®
  • Zeiss®
  • Leitz/Leica®
  • Nikon® 
请联系技术服务部门以了解适用于您显微镜的滤光片的价格和供货情况。
 
 
 
 
显微镜基础知识

一台配置合理、保养良好的荧光显微镜对于获得最佳的 FISH 结果至关重要。请务必严格遵守制造商关于显微镜的操作和保养说明。

 
 
 
 
激发灯光源

激发灯是能激发荧光团发射荧光信号的光源。激发光源的两个关键特征是发射光谱和强度。该灯的发射光谱必须在给定荧光团的吸收峰内才能产生荧光。激发强度越强,荧光越亮。然而,激发强度越亮,荧光团的光氧化或褪色越快。任何灯的选择都必须考虑到所查看图像的亮度与其保持可见的时间范围之间的权衡。Vysis 建议使用 100 瓦汞激发灯光源。

 
 
 
 
建议用于原位杂交的物镜
  • 选择最适用于荧光显微镜的物镜;高数值孔径 (~1.3)
  • 具有最少透镜元件的物镜,数值孔径 > 或 = 0.75
  • 不建议使用具有许多透镜元件的物镜,数值孔径 > 或 = 0.75

 

 
 
 
 
滤光片组

滤光片组被设计用于查看特定荧光团或者两种及以上荧光团的特定组合。荧光显微镜的滤光片组由三个元件组成:激发滤光片,用于选择用来激发荧光团的波长;二向色镜(分光镜或多色镜),用于将激发光向下反射至载玻片上的物体、阻挡大部分从载玻片反射回目镜的激发光以及使从原位杂交中的荧光团发射的光通过;以及最终的发射光滤光片(屏障滤光片),用于仅使来自荧光团的发射光通过,而在该指定范围外的任何其他波长会被阻挡。

 
 
 
 
单荧光团

滤光片组

滤光片分为三大类:带通、长通或短通。带通滤光片可传输一个波长区域内的波长,在某个较短波长下“切入”并在某个较长波长下“切断”。低于“切入”值或高于“切断”值的波长将通过吸收和/或反射被阻挡。带通或带宽 (BW) 是以纳米 (nm) 为单位的给定峰最大传输值 50% 处的峰宽。它也可被称为 FWHM (半峰全宽) 或 HPBW (半功率带宽)。长通滤光片传输高于指定值的波长并阻挡低于此值的波长。

 

短通滤光片与长通相反,即传输低于指定值的波长,而阻挡高于该指定值的波长。干涉滤光片是通过在玻璃基片上的真空沉积薄膜而制成的。薄膜由具有高折射率和低折射率的金属或电介质层交替组成。干涉滤光片可以被设计为短通、长通或带通滤光片。有色玻璃滤光片由染料浸渍玻璃制成,通常为长通或带通。滤光片可以包含有色玻璃和/或干涉类型的多个元件,通过光学环氧树脂层叠并粘合在一起(层合)。如果滤光片包含任何干涉元素,则称其为干涉滤光片。

 

干涉滤光片具有窄带宽、高传输效率和非常明确的“切入”和“切断”点,因而十分理想。这种滤光片更昂贵、更不耐用,并且通常比有色玻璃滤光片具有更高的信噪比 (S/N)。有色玻璃滤光片通常具有宽带宽(例如,FITC 激发滤光片的带宽为 40 nm)、较低的传输效率以及有拖尾的“切入”和“切断”点。使用有色玻璃滤光片是因为它们容易获得、成本较低且更耐用。 

 

激发滤光片通常是带通滤光片。激发滤光片可以是有色玻璃或干涉类型。带宽越大,激发能量越大。随着带宽的增加,发射强度也随之增加,但产生非特异性自发荧光的几率也更大。

 

二向色镜是干涉滤光片。二向色镜采用薄膜技术制造,但由于它们需要保持较薄以获得较高的图像质量,它们没有层合玻璃盖板的保护。不受保护的二向色镜很容易被划伤和损坏。使用 Zeiss Axioline 滤光片时,用户必须小心安装滤光片组,并且只能以戴手套的手碰触二向色镜的边缘。

 

发射光滤光片可以是带通或长通。

 

发射光滤光片可以是有色玻璃或干涉类型。长通滤光片可使最多的光通过,从而产生更明亮、但噪声更大的图像,即具有较高的背景信号和较低的信噪比 (S/N)。这种噪声和背景信号的增加是由细胞碎片、显微镜载玻片等造成的。

 
 
 
 

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