CGH 杂交:制备试剂

CGH 杂交:制备试剂

20X SSC, pH 5.3

将 66 g 20X SSC 在 200 mL 纯化水中彻底混合。使用浓盐酸和 QS 在室温下调节至 pH 5.3,最终体积调节为 250 mL。在室温下储存。在 6 个月后丢弃储备溶液,或者(更短时间内)在溶液出现浑浊或受污染时丢弃溶液。

 

变性溶液

将 49 mL 甲酰胺、7 mL 20X SSC (pH 5.3) 和 14 mL 纯化水添加至一个玻璃 Coplin 染色缸中并充分混合。通过测量室温下的 pH 值,验证 pH 值是否为 7.0 - 7.5。使用期之间,在 4°C 下储存。7 天后弃置。

 

乙醇洗液(70%、85% 和 100%)

用纯化水稀释 100% 乙醇 (v/v) 以制备洗涤液。使用期之间,在室温下储存。6 个月后弃置储备溶液。

 

0.4X SSC/0.3% NP-40 洗涤溶液

将 20 mL 20X SSC 与 950 mL 纯化水充分混合。添加 3 mL NP-40。充分混合,直至 NP-40 溶解。使用 NaOH 将 pH 值调节至 7.0 - 7.5。添加纯化水,使最终体积达到 1 L。在室温下贮存。在 6 个月后丢弃储备溶液,或者在溶液出现浑浊或受污染时丢弃溶液。

 

2X SSC/0.1% NP-40 洗涤溶液

添加 1 mL NP-40。使用 NaOH 将 pH 值调节至 7.0 - 7.5。添加纯化水,使最终体积达到 1 L。在室温下贮存。在 6 个月后丢弃储备溶液,或者在溶液出现浑浊或受污染时丢弃溶液。

 

检测 DNA

用 SpectrumGreenTM dUTP 直接标记的检测(和未标记的对照)DNA。请参阅 Vysis CGH Nick Translation Kit 以了解相关程序。

 
 
 
 
cgh 程序

对照 

阳性和阴性对照为评价 CGH 数据的杂交和判读提供了比较。对于阴性对照,使用正常 DNA 作为检测和参考 DNA(目录编号 32-804024、32-802024)。该实验的强度分布应当在由图像分析确定的阈值内。对于阳性对照,使用从具有易于通过 CGH 分析检测的已知遗传畸变的细胞系中提取的检测 DNA(目录编号 32-800227)。

 

正常中期 CGH 靶标玻片

请勿预处理玻片。玻片使用针对 CGH 优化的标准细胞遗传学玻片制备方法进行制备。玻片由植物凝集素 (PHA) 刺激的淋巴细胞制成,在加入胸苷使细胞同步化之前培养 48 - 72 小时。染色体长度为 400 - 550 条带。淋巴细胞来源于核型正常的男性供体。

 

配制探针混合物

为了产生与 SpectrumGreenTM 和 SpectrumRedTM 标记 DNA 的信号强度相等的杂交,增加了 SpectrumGreen 标记的 DNA 的量。

  1. 在 1.5 mL 微量离心管中混合以下物质:
    10 µL (200 ng) SpectrumGreen(切口平移标记的)检测 DNA;1 µL (100 ng) SpectrumRed 总基因组参考 DNA(目录编号 32-804023 或 32-804024)10 µL (10 µg) 人 COT-1-1 DNA(目录编号 32-800028)
  2. 加入 1 µL(0.1 体积)3 M 乙酸钠,然后加入 52.5 µL(2.5 体积)100% 无水乙醇以沉淀 DNA。短暂涡旋,置于干冰上 15 分钟。
  3. 在 4°C 下以 12,000 rpm 离心 30 分钟以沉淀 DNA。 
  4. 除去上清液并在室温下真空干燥沉淀 10 - 15 分钟。
  5. 将沉淀重悬于 3 µL 纯化水和 7 µL CGH 杂交缓冲液中。通过在 73°C 水浴中加热探针混合物 5 分钟使探针变性。注意:玻片脱水时使探针变性(将探针与靶标中期杂交的步骤 3)。

将探针与靶标中期杂交 

  1. 使用金刚石尖头划线标记玻片上的杂交区域。
  2. 确保变性溶液温度为 73 ± 1°C。将含有正常中期扩散的玻片浸入溶液 5 分钟。
  3. 玻片在 70% 乙醇溶液中脱水 1 分钟,然后在 85% 乙醇溶液中脱水 1 分钟,在 100% 乙醇溶液中脱水 1 分钟。
  4. 通过将玻片的底部边缘接触吸水纸并使用纸巾擦拭玻片的下侧来干燥玻片。
  5. 将玻片置于 45 - 50°C 玻片加热器上,使剩余的 EtOH 蒸发。
  6. 将 10 µL 变性探针混合物滴加至玻片上。 
  7. 立即盖上盖玻片并用稀释的橡胶胶水密封。
  8. 将玻片放入密封的加湿箱中,并置于 37°C 培养箱中 48 - 72 小时进行杂交。

洗涤玻片 

  1. 使用前,将含有 0.4X SSC/0.3% NP-40 洗涤液的洗涤容器置于 74 ± 1°C 的水浴中至少 30 分钟。使用 1 天后弃置。在室温下制备 2X SSC/0.1% NP-40 的第二个洗涤容器。
  2. 取下橡胶胶水密封和盖玻片,并立即将玻片放入温度为 74 ± 1°C 的 0.4X SSC/0.3% NP-40 洗涤液中。振荡玻片 1 - 3 秒。
  3. 对每张玻片重复步骤 2,一次洗涤不超过 4 张玻片,然后让玻片静置 2 分钟。
  4. 在室温下,将玻片置于 2X SSC/0.1% NP-40 洗涤液中。振荡玻片 1 - 3 秒,然后静置 5 秒至 1 分钟。
  5.  在黑暗处风干玻片。

杂交可视化

将 10 µL DAPI II 复染剂和盖玻片施加到每个杂交位置。

 

 
 
 
 

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