CEP:关键产品信息

CEP:关键产品信息

 

1.探针制备

  • 在室温下混合 7 µL CEP 杂交缓冲液、1 µL CEP DNA 探针和 2 µL 纯化水。*vysis-products-cep-protocol-1.gif
  • 离心 1-3 秒,涡旋混合,然后重新离心。
  • 在 73 °C 水浴中加热 5 分钟,然后放置在设定为 45 - 50 °C 的玻片加热器上。

*对于两种 CEP 探针的同时杂交,用 7 µL CEP 杂交缓冲液、1 µL 纯化水和 1 µL 两种不同的 CEP DNA 探针中的任一种代替。

 

2.玻片制备

  • 使用金刚石尖头划线标记杂交区域。vysis-products-cep-protocol-2.gif
  • 将载玻片浸入 73+/-1°C 变性剂浴(70% 甲酰胺/2X SSC)中 5 分钟。
  • 将载玻片置于 70% 无水乙醇中 1 分钟、85% 无水乙醇中 1 分钟以及 100% 无水乙醇中 1 分钟进行脱水。
  • 干燥玻片并将其置于玻片加热器 (45-50°C) 中最长 2 分钟。

 

3.杂交

  • 将 10 µL 探针混合物置于载玻片上。一旦将探针滴加至载玻片,立即盖上盖玻片 vysis-products-cep-protocol-3.gif。(载玻片在短时杂交过程中不需要密封)。
  • 将载玻片放入预热的非加湿箱中,并在 42 °C 培养箱中杂交至少 30 分钟(但不超过 60 分钟)。
  • 准备一个盛有 0.4X SSC/0.3% NP-40 的洗涤槽,并将其置于 73+/-1°C 的水浴中至少 30 分钟。使用 1 天后丢弃。在室温下准备盛有 2X SSC/0.1% NP-40 的第二个槽。
  • 取下盖玻片,立即放入 0.4X SSC/0.3%NP-40 洗涤槽中,振荡玻片 1 - 3 秒。对其他三张玻片重复上述步骤,然后将所有 4 张玻片置于 Coplin 染色缸中 2 分钟。
  • 在室温下将载玻片在 2X SSC/0.1% NP-40 中洗涤 5 秒至 1 分钟,当载玻片置于洗涤浴中时搅动 1-3 秒。
  • 使载玻片在黑暗中风干。

 

4.解读

vysis-products-cep-protocol-4.gif
  • 将 10 µL DAPI II 复染剂置于载玻片的目标区域,并加上盖玻片。
  • 使用合适的滤光片组查看玻片。

 

 

5.储存 vysis-products-cep-protocol-5.gif

  • 在 -20°C 黑暗中存放载玻片。 
 
 
 
 
CEP 程序注意事项

 

荧光团容易因曝光而发生光褪色。为了限制这种降解,请在暗光下处理所有含有荧光团的溶液,包括处理杂交载玻片时所涉及的有关步骤。请在黑暗中执行所有不需要在光照下进行操作的步骤(孵育期、洗涤等)。 

 

强烈建议使用经过校准的温度计来测量溶液的温度。 

 

在首次打开每小瓶试剂前,使用标准台式微量离心机离心 2 - 3 秒。 

 

使用前约 30 分钟,将含有变性溶液的室温 Coplin 染色缸置于 73 +/- 1 °C 水浴中。 

 

如果对四张以上的载玻片进行了杂交,则不得于同一批次对它们进行洗涤。在洗涤每个批次之前,洗涤溶液的温度必须恢复到 73 +/-1°C。

 

 
 
 
 
CEP 工作试剂的配制

 

20X SSC(制备 500 mL 20X SSC,pH 5.3) 

将 132 克 20X SSC 加入 400 mL 水中并充分混合。在室温下借助 pH 计使用浓 HCl 将 pH 值调节至 5.3,并将最终体积调整至 500 mL。通过 0.45 微米孔径过滤装置进行过滤。在室温下可贮存不超过六个月。

 

2X SSC/0.1% NP-40(制备 1 升)

将 100 mL 20X SSC (pH 5.3) 添加至 850 mL 纯化水中。添加 1.0 mL NP-40。借助 pH 计使用 NaOH 将 pH 值调节至 7.0-7.5。添加水,使溶液的最终体积达到 1 升。在室温下可贮存不超过六个月。  

 

0.4X SSC/0.37 NP-40 洗涤溶液 

添加水,使溶液的最终体积达到 1 升。通过 0.45 微米孔径过滤器进行过滤。在室温下可贮存不超过六个月。注意:使用前,洗涤溶液必须置于 73 +/- 1 °C 下。为了保持适当的温度范围,必须一次将四张玻片置于加热的溶液中。如果杂交的玻片少于四张,则必须使用室温下的显微镜载玻片将数量增加到四张。如果杂交了四张以上的玻片,则必须在多个批次中对其进行洗涤。在洗涤每个批次之前,洗涤溶液的温度必须恢复到 73 +/-1°C。请勿在将任一载玻片置入洗涤浴前一同取下数张载玻片的盖玻片。在最后一张载玻片被添加到洗涤浴中后,开始对孵育计时。

 

变性溶液(制备 70 mL) 

将 49 mL 甲酰胺、7 mL 20X SSC (pH 5.3) 和 14 mL 纯化水添加至一个玻璃 Coplin 染色缸中并充分混合。在室温下使用 pH 计测量 pH 值以确认 pH 值介于 7.0-8.0 之间。每个批次的变性剂可使用七天,然后丢弃。在使用周期之间,在 4°C 温度下贮存。

 

乙醇洗涤溶液 

最终浓度为 70%、85% 和 100%。用水将 100% 乙醇按照 v/v 进行稀释。稀释液使用最多七天后弃置。如果溶液蒸发或稀释,请更换为新的溶液。在使用周期之间,在室温下贮存。

 
 
 
 

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