Domande frequenti

Applicazioni

 

Posso eseguire la FISH più di una volta sulla stessa zona di ibridazione?

Sì. Vedere la sezione del protocollo relativa alla FISH sequenziale.

 

Qual è la dimensione minima di DNA (sequenza di DNA contiguo) che è possibile osservare usando le sonde Vysis a marcatura diretta (CEP o LSI)?

La dimensione dipende da numerosi fattori; in genere, il limite minimo è di circa 30 chilobasi.

 

In che modo si mescolano assieme 2 sonde?

Aggiungere 7 µl di tampone di ibridazione, 1 µl di acqua purificata e 1 µl di CIASCUNA sonda, per un volume totale di 10 µl.

 
 
 
 
Filtri

 

Quali sono i filtri raccomandati per PathVysion, UroVysion e AneuVysion?

  • PathVysion: (3 filtri) verde/arancione v.2, DAPI/9-Arancione e filtro a banda passante singola verde. 
  • UroVysion: (4 filtri) DAPI, rosso/verde, oro e aqua. 
  • AneuVysion: (4 filtri) DAPI/Arancione/Verde, filtro a banda passante singola verde, filtro a banda passante singola arancione e filtro a banda passante singola aqua. 

Per informazioni sui filtri in altri prodotti, si prega di contattare il Servizio Tecnico Vysis al numero 1-800-553-7042 Opzione 2.

 

Qual è la sorgente luminosa ottimale per la visualizzazione della fluorescenza?

Si raccomanda una lampada al mercurio da 100 Watt che deve essere cambiata ogni 200 ore.

 

Perché i segnali fluorescenti che ottengo sono deboli?

Oltre all'utilizzo del filtro appropriato, la luce di eccitazione del microscopio e l'usura della lampada influiscono sulla potenza con la quale appare il segnale del fluoroforo. Si raccomanda una lampada al mercurio da 100 Watt con meno di 200 ore di utilizzo. I segnali di alcune sonde sono più luminosi oppure hanno forme diverse se paragonati ad altri. Ad esempio, il segnale di una sonda LSI® è più compatto rispetto a quello di una sonda CEP® e l'osservatore potrebbe interpretarlo come un segnale meno luminoso. In realtà, il segnale della sonda LSI è solo più piccolo. Painting cromosomici WCP® differenti hanno intensità di colorazione diverse e, all'occhio di un osservatore, una particolare colorazione WCP® potrebbe apparire non tanto luminosa quanto un'altra utilizzata in precedenza.

 

È possibile utilizzare un filtro TexasRed per visualizzare le sonde Vysis SpectrumOrange?

No. Le sonde marcate con SpectrumOrange richiedono l'utilizzo di un filtro Vysis SpectrumOrange. Le lunghezze d'onda del rosso e dell'arancione sono abbastanza vicine nello spettro per poterne visualizzare i segnali, ma l'intensità di questi ultimi non sarà riproducibile.

 

È possibile utilizzare un filtro oro per visualizzare le sonde Vysis SpectrumOrange ?

No. Le sonde marcate con SpectrumOrange richiedono l'utilizzo di un filtro Vysis SpectrumOrange. Le lunghezze d'onda dell'oro e dell'arancione sono abbastanza vicine nello spettro per poterne visualizzare i segnali, ma l'intensità di questi ultimi non sarà riproducibile.

 
 
 
 
Generale

 

Qual è la differenza tra l'approvazione e l'autorizzazione da parte della FDA?

L'approvazione della FDA fa riferimento a prodotti la cui immissione in commercio è stata approvata in base alla procedura di PMA (approvazione premarket) per i nuovi dispositivi. L'autorizzazione della FDA fa riferimento a dispositivi la cui immissione in commercio è stata autorizzata in base alla procedura di riesame 510(k). In generale, la procedura di PMA è più severa e riguarda la commercializzazione di prodotti completamente nuovi. I dispositivi che sono invece concettualmente simili ad altri già presenti sul mercato, o che rappresentano un miglioramento rispetto ai prodotti esistenti, possono optare per l'autorizzazione della FDA con la procedura di notifica premarket 510(k).

 

Vysis può consigliare in che modo refertare un paziente?

No. Vysis non è un laboratorio clinico e non è in grado di offrire pareri su come refertare un paziente. Inoltre, Vysis non può offrire consulenza sulla nomenclatura.

 

Qual è la differenza tra ASR e IVD?

ASR corrisponde a reagente analita specifico. I reagenti analita specifici (ASR) sono prodotti destinati ai test domestici sulla fermentazione con garanzia di GMP (buone pratiche di fabbricazione) da parte del produttore. I reagenti analita specifici (ASR) devono essere etichettati in conformità con quanto riportato al Titolo 21 del Code of Federal Regulations § 809.10(e). I materiali pubblicitari e promozionali sono regolati in base al Titolo 21 del Code of Federal Regulations § 809.30(d). In base a quanto stabilito al Titolo 21 del Code of Federal Regulations § 809.30(e), il laboratorio che sviluppa un test in-house utilizzando reagenti analita specifici (ASR) è tenuto a informare il committente del risultato del test corredando il rapporto con la seguente dichiarazione: "(Nome del laboratorio) ha sviluppato il presente test e ne ha determinato le caratteristiche di prestazione. Il presente test non è stato autorizzato o approvato dalla FDA degli Stati Uniti d'America." I reagenti analita specifici (ASR) non hanno alcuna destinazione d'uso specifica dichiarata; il laboratorio ha la responsabilità di stabilire quale sia la destinazione d'uso e le soglie di cutoff. Esempi di prodotti Vysis ASR: LSI® bcr/abl, LSI DiGeorge, TotelVysionIVD, per utilizzo nella diagnostica in vitro - Prodotto di diagnostica autorizzato o approvato dalla FDA per una o più destinazioni d'uso specifiche con caratteristiche di prestazione analitica e clinica definite. Esempi di prodotti Vysis IVD: PathVysion, UroVysion, AneuVysion, CEP® 8 SO, CEP 12 SO, CEP X/Y.

 

Perché i numeri di lotto sulle fiale sono diversi da quelli dei kit?

Il numero di lotto che appare sul Certificato di analisi fornito con ogni sonda corrisponde al numero di lotto del kit. La maggior parte dei kit includono una fiala di sonda e una fiala di tampone di ibridazione. Altri kit contengono una sonda premiscelata con tampone di ibridazione. Ciascun componente è dotato di un codice articolo e di un numero di lotto unici e distinti da quelli del kit. Quando si ordina un prodotto dal nostro catalogo, il codice da utilizzare è il codice catalogo e non i singoli codici articolo che appaiono sulle fiale contenute nel kit.

 
 
 
 
Sonde

 

Quanto sono stabili le sonde? È possibile congelarle-scongelarle? È possibile conservarle diluite? 

Se conservate correttamente, le sonde sono stabili. Possono essere congelate e scongelate più e più volte. Il rischio di degradazione delle sonde è minore se vengono conservate non diluite.

 

È necessario amplificare il segnale?

No, non è necessario amplificare il segnale. Le sonde Vysis a marcatura diretta presentano un segnale luminoso senza necessità di ulteriori passaggi per il rilevamento.

 

È possibile diminuire la quantità di sonda per saggio?

No, la forza del segnale sarebbe troppo debole.

 

Qual è la differenza tra sonde a marcatura diretta e indiretta?

Nelle sonde a marcatura diretta, il fluoroforo è legato covalentemente con la sonda DNA. Nelle sonde a marcatura indiretta è presente un aptene, come biotina o digossigenina, incorporato nella sonda. Una serie di passaggi post-ibridazione (metodo a "sandwich") consente al fluoroforo di legarsi all'aptene.

 

In quali occasioni si utilizzano le sonde WCP e quando invece le sonde CEP?

Le sonde CEP sono usate sia su cellule in interfase che su cromosomi in metafase e possono essere utilizzate per determinare la ploidia (ad es. trisomia 18). Le sonde WCP Whole Chromosome Painting (painting cromosomico totale) sono usate unicamente sulle metafasi. La comunità scientifica sconsiglia l'uso di cellule in interfase a causa delle difficoltà di interpretazione dei risultati.

 

Le sonde WCP presentano una reazione crociata con altri cromosomi umani o murini?

Con le sonde WCP potrebbero verificarsi reazioni crociate con altri cromosomi umani. La miscela di sonda contiene DNA Human Cot-1®* al fine di ridurre il legame alle sequenze ripetute sul DNA target e non-target. È possibile aggiungere una maggiore quantità di DNA Human Cot-1. Alcune delle sonde WCP sono preparate a partire da librerie di DNA di cromosomi umani discriminati mediante flow-sorting e ottenuti da ibridi somatici di cellule umane e murine. Se si stanno analizzando ibridi di cellule somatiche per verificarne il contenuto cromosomico umano, utilizzare DNA Hamster Cot1 o DNA Mouse Cot1 (Gibco/BRL) come reagente di bloccaggio.

 

Se si miscelano le sonde LSI e CEP, quale tampone di ibridazione viene utilizzato?

Utilizzare il tampone di ibridazione LSI. Il tampone CEP è quello con una stringenza più elevata, mentre il tampone LSI ha una stringenza più bassa. La LSI richiede un tampone meno stringente o potrebbe non ibridare sul target. Non tutte le configurazioni di combinazione di sonde LSI e CEP sono state testate da Vysis. È possibile che, per alcune miscele di sonda, la sonda CEP possa andare incontro a ibridazione crociata con altri cromosomi a causa di condizioni di bassa stringenza.

 

In che modo si mescolano assieme 2 sonde?

Aggiungere 7 µl di tampone di ibridazione, 1 µl di acqua purificata e 1 µl di CIASCUNA sonda, per un volume totale di 10µl.

 

Perché i segnali fluorescenti che ottengo sono deboli?

Oltre all'utilizzo del filtro appropriato, la luce di eccitazione del microscopio e l'usura della lampada influiscono sulla potenza con la quale appare il segnale del fluoroforo. Si raccomanda una lampada al mercurio da 100 Watt con meno di 200 ore di utilizzo. I segnali di alcune sonde sono più luminosi oppure hanno forme diverse se paragonati ad altri. Ad esempio, il segnale di una sonda LSI è più compatto rispetto a quello di una CEP e l'osservatore potrebbe interpretarlo come un segnale meno luminoso. In realtà, il segnale della sonda LSI è solo più piccolo. Painting cromosomici WCP differenti hanno intensità di colorazione diverse e, all'occhio di un osservatore, una particolare colorazione WCP potrebbe apparire non tanto luminosa quanto un'altra utilizzata in precedenza. Se paragonato ad alcuni segnali amplificati di sonde a marcatura indiretta, il segnale delle sonde a marcatura diretta potrebbe essere descritto da alcuni osservatori come debole. I segnali delle sonde Vysis potrebbero sembrare più piccoli, ma sono altrettanto luminosi. Inoltre, grazie alla mancanza di fluorescenza di fondo, il segnale è più facile da individuare e distinguere come segnale vero e proprio.

 
 
 
 
Preparazione del campione

 

Come devono apparire i vetrini (con preparazioni di metafase) prima di procedere alla FISH?

È bene controllare le preparazioni dei vetrini con un microscopio a contrasto di fase.

  • In una buona preparazione: i cromosomi e i nuclei dovrebbero essere di colore grigio opaco, non rifrangenti e con una quantità di citoplasma minima.
  • In una cattiva preparazione: le cellule saranno "luminose", appariranno biancastre e con un alone attorno ai nuclei. Possibile causa: il campione sui vetrini potrebbe essersi asciugato troppo rapidamente durante la preparazione. Soluzione:
    • aumentare l'umidità attorno al vetrino quando si "deposita" il campione, collocandolo su un rack a bagnomaria a 65°C per 20 minuti.
    • Non cuocere i vetrini; la cottura dei vetrini può influenzare negativamente i risultati dell'ibridazione.
    • Asciugare i vetrini a temperatura ambiente per una notte. I migliori risultati si ottengono quando i vetrini vengono invecchiati per una notte a temperatura ambiente.
  • I vetrini preparati e utilizzati nello stesso giorno non danno risultati ottimali, ma se si desidera preparare i vetrini in un solo giorno si possono seguire i passaggi descritti di seguito: asciugare il vetrino dapprima su uno scaldavetrini a 45°C per 30 minuti, quindi disidratare il vetrino per un minuto per volta in soluzioni di etanolo al 70%, 85% e 100% prima di procedere alla denaturazione del DNA target (Passaggio 1 per la FISH).

 

Dopo la FISH, il segnale che compare è debole e il vetrino appare "velato". Come posso intervenire?

Di solito, la causa è dovuta a un'eccessiva densità di cellule presenti sul vetrino. Questo "velo" è dovuto al citoplasma cellulare. Provare a lavare il pellet cellulare con del fissativo fresco, diluire il campione e collocarlo su un nuovo vetrino. Alcuni tipi di campioni (touch prep, strisci di midollo osseo o di sangue, campioni inclusi in paraffina) sono potenzialmente più inclini a presentare questo problema. Questi tipi di campioni possono necessitare di trattamenti aggiuntivi:

  • Strisci: lavare in acido acetico al 70% per 30 secondi, asciugare all'aria, lavare in metanolo al 100% per 30 secondi.
  • Campioni inclusi in paraffina: aumentare il tempo di digestione delle proteine.

 

Perché il colorante di contrasto è troppo debole?

I vetrini potrebbero non essere stati asciugati correttamente prima dell'applicazione del colorante di contrasto. Assicurarsi di lasciare invecchiare i vetrini per 24 ore dopo aver depositato le cellule. Provare a disidratare i campioni mediante una serie di lavaggi con etanolo, poi contro-colorare nuovamente. Inoltre, assicurarsi di avere il filtro corretto per la visualizzazione del colorante di contrasto. Vysis dispone di due concentrazioni del colorante di contrasto DAPI. DAPI II (125 ng/ml) si utilizza con le sonde CEP® e LSI® ed è una diluizione a un ottavo di DAPI I (1000 ng/ml) che si usa con i painting cromosomici WCP®. L'uso di DAPI II con le sonde WCP può produrre una colorazione di contrasto troppo debole.

 

Come mai la morfologia cellulare del mio campione è distorta?

Tipi di tessuto o di campione diversi possono richiedere tempi di denaturazione differenti. Se il tempo di denaturazione è troppo lungo per quel tipo di campione, le cellule appariranno distorte. Per iniziare, provare con un tempo di denaturazione di quattro minuti, quindi regolare le tempistiche di conseguenza.

 

Per quanto tempo posso conservare i vetrini preparati e ibridarli comunque in modo efficace?

Se i vetrini vengono conservati sotto azoto a -20°C, dovrebbero essere utilizzabili per almeno sei mesi.

 

Per quanto tempo dopo l'ibridazione è possibile conservare i vetrini e continuare a vedere la fluorescenza?

Se i vetrini vengono conservati a -20°C e non sono esposti troppo spesso alla luce UV ad alta intensità della lampada al mercurio, dureranno diversi mesi. I segnali sbiadiranno nel tempo e con l'esposizione alla luce.

 

Posso eseguire la FISH dopo aver effettuato il bandeggio G sui cromosomi in metafase?

Sì, la procedura è presente nel seguente riferimento bibliografico:

 

JalalSM, Law ME, Christensen ER, Spurbeck JL, Dewald GW. Method forsequential staining of GTLbanded metaphases with fluorescentlabeledchromosome specific paint probes. Am J Med Genet 46:98103, 1993.

 
 
 
 
Reagenti

 

Perché le procedure Vysis non prevedono l'aggiunta di anti-fade al test FISH?

Tutti i coloranti di contrasto Vysis, DAPI I, DAPI II, ioduro di propidio, contengono un anti-fade nella propria soluzione.

 

La soluzione di lavaggio contenente NP-40 allo 0,1% diventa torbida quando la riscaldo. Cosa c'è che non va?

Non c'è niente che non vada. L'aspetto torbido è normale e non interferisce con il lavaggio.

 

Che differenza c'è tra DAPI I e DAPI II?

DAPI I ha una concentrazione di 1000 ng/ml, circa 8 volte la concentrazione di DAPI II, che è di 125 ng/ml. Il DAPI I, più concentrato, funziona bene con i painting cromosomici WCP® e offre una colorazione di contrasto visivamente luminosa per i cromosomi in metafase. Il DAPI II, meno concentrato, è da utilizzare con le sonde CEP® e LSI® caratterizzate da segnali più compatti, che potrebbero essere sopraffatti da un'eccessiva colorazione di contrasto con DAPI del DNA nucleare.

 

Qual è la differenza tra i Kit di pretrattamento in paraffina I, II e III?

Il kit di pretrattamento in paraffina I deve essere utilizzato con PathVysion® Her-2/neu su campioni di tessuto. Questo kit è stato approvato dalla FDA. Si tratta di un pretrattamento più dispendioso in termini di tempo (circa un'ora in più) rispetto al kit II. Il Kit di pretrattamento in paraffina II è un protocollo di pretrattamento più breve da utilizzare su sezioni in paraffina diverse da quelle per PathVysion Her-2 e per il tessuto prostatico. Il Kit di pretrattamento in paraffina III è un protocollo più rigoroso che dovrebbe essere utilizzato sul tessuto prostatico o per la risoluzione di problemi nel caso di campioni che presentano difficoltà. Al posto della pepsina, questo kit contiene l'enzima proteinasi K.

 

Quali sono gli elementi che compongono il tampone di ibridazione?

  • Tampone di ibridazione CEP: formammide al 55%, 1X SSC, destran solfato al 10%
  • Tampone di ibridazione LSI/WCP: formammide al 50%, 2X SSC, destran solfato al 10%
 
 
 
 

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