Elaborazione dei campioni di urina

  1. Centrifugare l'urina in una provetta da centrifuga da 50 ml a 600 g per 10 minuti a temperatura ambiente (15-30ºC).
  2. Rimuovere il surnatante in un raggio di circa 1 - 2 ml di pellet cellulare, prestando attenzione a non disturbare il pellet.
  3. Risospendere il pellet nei restanti 1-2 ml di surnatante e trasferire il contenuto in una provetta per centrifuga conica da 15 ml. Sciacquare la provetta da 50 ml con 10 ml di PBS 1X e trasferire il contenuto nella provetta da 15 ml.
  4. Centrifugare il campione (o i campioni) a 600 g per 10 minuti a temperatura ambiente.
  5. Rimuovere il surnatante in un raggio di circa 0,5 ml di pellet cellulare.
  6. Risospendere il pellet nel restante 0,5 ml di surnatante. Aggiungere lentamente 1-5 ml di fissativo fresco (3:1 metanolo:acido acetico), in un primo momento goccia a goccia, agitando spesso.
  7. Lasciare a riposo i campioni fissati a -20ºC per almeno trenta minuti
  8. Centrifugare il campione (o i campioni) a 600 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela il surnatante.
  9. Lavare il pellet mediante risospensione in 1-5 ml di fissativo.
  10. Centrifugare il campione (o i campioni) a 600 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere i passaggi 8 e 9 due volte.
  11. Dopo la centrifugazione della sospensione cellulare nel fissativo:
    • Se il pellet cellulare è molto piccolo e poco visibile, rimuovere CON CAUTELA la maggior quantità possibile di fissativo, lasciando circa 100 µl di soluzione. 
    • Se il pellet cellulare è facilmente visibile, rimuovere la maggior quantità possibile di fissativo e aggiungere 0,5-1 ml di fissativo fresco per il pellet cellulare.
  12. Procedere immediatamente con il protocollo di pretrattamento dei vetrini. Segue poi il kit di pretrattamento per FISH. 

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