ToTelVysion TM: Miscele di sonde DNA multicolore per FISH

ToTelVysionTM: Miscele di sonde DNA multicolore per FISH

Pretrattamento del campione prima della codenaturazione.

 

La seguente procedura di pretrattamento è altamente raccomandata prima dell'ibridazione delle sonde ToTelVysion sulle preparazioni dei vetrini di metafase. Lo scopo di questa procedura è quello di rendere il DNA cromosomiale accessibile per l'ibridazione e per proteggere la morfologia dei cromosomi dal processo di codenaturazione.

  1. Incubare i vetrini del campione in una vaschetta Coplin contenente soluzione 2X SSC a 73°C per 2 minuti. 
  2. Incubare i vetrini in una vaschetta Coplin contenente soluzione di proteasi/pepsina per 10 minuti a 37°C. 
  3. Lavare i vetrini in una vaschetta Coplin contenente PBS a temperatura ambiente per 5 minuti. 
  4. Posizionare i vetrini in una vaschetta Coplin contenente soluzione di formaldeide per 5 minuti a temperatura ambiente. 
  5. Rimuovere i vetrini dalla soluzione di formaldeide e lavare in una vaschetta Coplin contenente PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. 
  6. Disidratare i vetrini per 1 minuto in etanolo al 70%, successivamente 1 minuto in etanolo all'85% e 1 minuto in etanolo al 100%. 
  7. Lasciar asciugare i vetrini all'aria.

 

La miscela di sonda DNA multicolore per FISH ToTelVysion è costituita da un totale di 62 sonde di DNA FISH.

 

 
Componente Sonda DNA multicolore ToTelVysion
Quantità 30 µl x 15 fiale contenenti varie miscele di sonde
Composizione Sonde marcate con fluorofori, TelVysion CEP® e LSI® e DNA bloccante mescolato con un tampone di ibridazione contenente destrano solfato, formammide e SSC (pH 7.0)
Conservazione -20°C al riparo dalla luce 
 
 
FIALA TOTELVYSION N. DESCRIZIONE DELLA MISCELA DI SONDE
Miscela 1 TelVysion1p SpectrumGreen, TelVysion 1q SpectrumOrange, TelVysion Xp/Yp SpectrumOrange e SpectrumGreen, CEP X SpectrumAqua
Miscela 2 TelVysion 2p SpectrumGreen, TelVysion 2q SpectrumOrange, TelVysion Xq/Yq SpectrumOrange e SpectrumGreen, CEP X SpectrumAqua
Miscela 3

TelVysion 3p SpectrumGreen, TelVysion 3q SpectrumOrange, TelVysion 22q SpectrumOrange e SpectrumGreen, LSI bcr (22q11) SpectrumAqua

Miscela 4 TelVysion 4p SpectrumGreen, TelVysion 4q SpectrumOrange, TelVysion 21q SpectrumOrange e SpectrumGreen, LSI AML (21q22) SpectrumAqua
Miscela 5 TelVysion 5p SpectrumGreen, TelVysion 5q SpectrumOrange 
Miscela 6 TelVysion 6p SpectrumGreen, TelVysion 6q SpectrumOrange, TelVysion 13q SpectrumOrange e SpectrumGreen, LSI 13 (13q14) SpectrumAqua
Miscela 7 TelVysion 7p SpectrumGreen, TelVysion 7q SpectrumOrange, TelVysion 14q SpectrumOrange e SpectrumGreen, LSI TCR (14q11.2) SpectrumAqua
Miscela 8 TelVysion 8p SpectrumGreen, TelVysion 8q SpectrumOrange, TelVysion 17p SpectrumOrange e SpectrumGreen, CEP 17 SpectrumAqua
Miscela 9 TelVysion 9p SpectrumGreen, TelVysion 9q SpectrumOrange, TelVysion 17q SpectrumOrange e SpectrumGreen, CEP 17 SpectrumAqua
Miscela 10 TelVysion 10p SpectrumGreen, TelVysion 10q SpectrumOrange, TelVysion 15q SpectrumOrange e SpectrumGreen, LSI PML (15q22) SpectrumAqua
Miscela 11 TelVysion 11p SpectrumGreen, TelVysion 11q SpectrumOrange, TelVysion 18p SpectrumOrange e SpectrumGreen, CEP 18 SpectrumAqua
Miscela 12 TelVysion 12p SpectrumGreen, TelVysion 12q SpectrumOrange, TelVysion 18q SpectrumOrange e SpectrumGreen, CEP 18 SpectrumAqua
Miscela 13 TelVysion 16p SpectrumGreen, TelVysion 16q SpectrumOrange
Miscela 14 TelVysion 19p SpectrumGreen, TelVysion 19q SpectrumOrange, LSI 19p13 SpectrumAqua
Miscela 15 TelVysion 20p SpectrumGreen, TelVysion 20q SpectrumOrange 

 

 

Attrezzature necessarie ma non fornite

  • 12N HCI (per regolare il pH delle soluzioni di lavaggio) 
  • 1 N Na OH (per regolare il pH delle soluzioni di lavaggio) 
  • Vaschette Coplin
  • Termometro calibrato 
  • Pinze 
  • Cilindro graduato (100 -1000 ml)
  • Agitatore magnetico 
  • Etanolo al 100% 
  • Microcentrifuga 
  • Puntali di micropipette per 1 - 10 µl volumi 
  • Micropipetta per 1 - 10 µl volumi 
  • Misuratore di pH 
  • Vetrini prelavati in vetro per microscopio 
  • Acqua purificata (acqua distillata o deionizzata) 
  • Timer 
  • Miscelatore vortex 
  • Bagnomaria (37°C e 73°C)
  • Microscopio a fluorescenza 
  • Incubatore a 37°C 
  • 20X Citrato di sodio standard (SSC), 500 g (Elenco n. 02J10-032) NP-40, 4000 µl (Elenco n. 07J05-001; Quantità 2)
  • Formammide, grado ultra puro 
  • Colorante di contrasto DAPI II 
  • Scalda vetrini (45-50°C) 
  • Olio da immersione per microscopio a fluorescenza 
  • Mastice 
  • Coprioggetti (12 mm tondo)
  • Marcatore a punta di diamante
  • Siringa monouso
  • Strisce indicatrici pH
  • Unità di filtrazione 0,45 uM
  • Camera umidificata
  • Soluzione salina tampone fosfato (PBS) 
  • Formalina neutra tamponata al 10% 
  • 2M cloruro di magnesio (MgCl2) 
  • Proteasi/pepsina

 

Preparazione del bersaglio campione

Per ibridare tutti le 15 miscele ToTelVysion, utilizzare un minimo di 3 vetrini di campione con 5 aree bersaglio marcate a vetrino per un totale di quindici aree bersaglio.

 

totelvysion-multi-color-dna-fish-probe-mixtures-slide.gif

Esempio di vetrino n. 1 contenente bersagli 1, 2, 3, 4 e 5. Ripetere lo stesso tipo di organizzazione di bersagli per i vetrini 2 e 3, con 5 bersagli su ciascun vetrino.

 

 
 
 
 
Preparazione della sonda

Preparazione della sonda e aggiunta di miscela di sonde al vetrino del campione

  1. Ciascuna miscela di sonde ToTelVysion viene pre-miscelata e preparata nel tampone di ibridazione. Rimuovere le fiale da -20°C (±5°C). Scongelare a temperatura ambiente. 
  2. Centrifugare ciascuna delle fiale scongelate della miscela di sonde per 1 - 3 secondi in una microcentrifuga. 
  3. Agitare e quindi centrifugare di nuovo brevemente. 
  4. Rimuovere 3 µl di sonda dalla fiala utilizzando una micropipetta e porre in una provetta della microcentrifuga. Preparare la sonda da ciascuna delle 15 fiale in questo stesso modo. 
  5. Posizionare ciascuna delle provette per microcentrifuga contenenti 3 µl di sonda a bagnomaria a 73 ± 1°C per 5 minuti per denaturare la sonda. 
  6. Rimuovere le provette dal bagnomaria. 
  7. Posizionare le provette su uno scalda vetrini a 45 - 50°C fino a quando non si è pronti per applicare la sonda al DNA bersaglio.

Nota: Se i vetrini sono pronti quando la sonda è denaturata, è possibile applicare immediatamente la sonda al DNA bersaglio. 

 

Ibridizzazione della sonda al bersaglio del campione

Nota: Preparare un contenitore umido collocando una salvietta di carta inumidita con acqua sul lato di un contenitore a tenuta ermetica. 

  1. Rimuovere i vetrini dall'etanolo al 100%. 
  2. Asciugare i vetrini toccandone il bordo inferiore con un foglio di carta assorbente e strofinando il lato inferiore con un tovagliolo di carta. 
  3. Posizionare i vetrini su uno scalda vetrini a 45 - 50°C fino a 2 minuti per far evaporare l'etanolo residuo. 
  4. Applicare 3 µl di miscela di sonde a 1 area bersaglio e applicare immediatamente il vetrino coprioggetti rotondo di 12 mm. Ripetere la procedura per le altre 14 aree bersaglio.

Nota: Non permettere che i coprioggetti di ciascuna area bersaglio si tocchino. L'azione capillare tra i coprioggetti in contatto causerà lo spostamento della sonda dal bersaglio 1 all'altro.

 

5. Sigillare il vetrino coprioggetti con il mastice, assicurando che quest'ultimo si sovrapponga al bordo del vetrino coprioggetti per creare una tenuta stagna tra il vetrino coprioggetti e la superficie di scorrimento. 

 

6. Posizionare i vetrini nel contenitore preriscaldato che verrà posto in un incubatore a 37 °C per 12 - 24 ore. 

 

Lavaggio del vetrino

Preparare le soluzioni di lavaggio:

Nota: Portare le soluzioni alla temperatura appropriata prima di iniziare la procedura di lavaggio.

  • Versare 70 ml di 0,4X SSC/0,3% NP-40 in una vaschetta Coplin. Posizionare la vaschetta a bagnomaria a 73 ± 1°C per almeno 30 minuti prima dell'uso. Utilizzare 1 giorno, poi eliminare.
  • Versare 70 ml di 2X SSC/0,1% NP-40 in una vaschetta Coplin. Utilizzare a temperatura ambiente. Utilizzare 1 giorno, poi eliminare.

Nota: Per mantenere la corretta temperatura nel 0,4X SSC/0,3% NP-40, lavare 4 vetrini simultaneamente. Se si dispone di meno di 4 vetrini, aggiungere vetrini vuoti che si trovano a temperatura ambiente fino a raggiungere un totale di 4.

 

 7.  Rimuovere i coprioggetti da un vetrino e immergere immediatamente i vetrini nel 0,4X SSC/0,3% NP-40 a 73 ± 1°C. Agitare i vetrini per 1 - 3 secondi. Ripetere con altri vetrini.  

 

8.   Rimuovere i vetrini dopo 2 minuti.

 

9.  Immergere i vetrini in 2X SSC/0,1% NP-40 a temperatura ambiente. Agitare i vetrini per 1 - 3 secondi. Rimuovere i vetrini dopo 30 secondi - 2 minuti 

 

Visualizzazione dell'ibridazione

  1. Far asciugare il vetrino all'aria e al buio.
  2. Applicare 3 µl di colorante di contrasto DAPI II per ciascuna area bersaglio dei vetrini e applicare un vetrino coprioggetti rotondo di 12 mm. In alternativa, applicare 10 µl di colorante di contrasto DAPI II su ciascuna metà dei vetrini e applicare un vetrino coprioggetti di 22 x 50mm sul colorante di contrasto. Applicare una leggera pressione sulla parte superiore del vetrino coprioggetti per rimuovere l'eccesso di DAPI. Tamponare con un tovagliolo di carta. 

Impostazione dei parametri ThermoBrite

Posizionare immediatamente ciascun vetrino (con la sonda e il coprioggetti applicati) sulla piastra di superficie di ThermoBrite. Inumidire i cartoncini umidificanti con acqua e posizionare il coperchio.

  1. Sigillare ogni coprioggetti con mastice facendo in modo che il mastice si sovrapponga al bordo del vetrino coprioggetti per creare una tenuta stagna tra il coprioggetti e la superficie di scorrimento.
  2. Per amniociti e linfociti in coltura, impostare Denat Temp a 70°C e il Denat Time a 3 minuti. (Nota: Queste temperature possono rendere necessarie regolazioni a seconda del tipo di campione. Fare riferimento al Manuale dell'Operatore di ThermoBrite (55-005322).
  3. Impostare il Hyb Temp a 37 °C e l'Hyb Time per tutta la notte (12 -16 ore).
  4. Quando il tempo di ibridazione è completato, lavare i vetrini utilizzando la Procedura di lavaggio rapida come descritto in precedenza.
  5. Lasciare asciugare il vetrino all'aria e al buio.
  6. Applicare 3 µl di colorante di contrasto DAPI II per ciascuna area bersaglio del vetrino e applicare un vetrino coprioggetti rotondo di 12 mm.
 
 
 
 

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