Colorazione dei vetrini prima della FISH: Preparazione delle soluzioni

Preparazione delle soluzioni
  • Preparare la soluzione madre di pepsina. Mantenere congelata. Sciogliere 0,5 g di pepsina in 5 ml di acqua distillata. La concentrazione di pepsina è 100 mg/ml.
  • Preparare la soluzione di lavoro di pepsina (0,05 mg/ml). Aggiungere 20 µl di soluzione madre di pepsina in 40 ml di HCl 10mM. La concentrazione finale di pepsina è 0,05 mg/ml.
  • Soluzione fissativa a base di formaldeide all'1% (V=400 ml). Mescolare 10 ml di formaldeide al 37% con 386 ml di PBS 1X e 4 ml di 100X MgCl2 100X MgCl2 = 2 M MgCl2. Conservare in frigorifero. Eliminare dopo ogni uso. Eliminare la soluzione dopo ogni uso.
 
 
 
 
Rimozione dei vetrini coprioggetti
  1. Immergere i vetrini in xilene per circa 48 ore a temperatura ambiente o fino a quando i vetrini coprioggetti non vengano rimossi facilmente o cadano dal vetrino.
  2. Lavare i vetrini in xilene fresco per 5 min. Si consiglia di fare il terzo lavaggio con xilene in una nuova soluzione per 5 min
  3. Far asciugare i vetrini all'aria per circa 15 min.
  4. Porre i vetrini in una vaschetta Coplin contenente etanolo al 95%. Può essere conservata per diversi giorni/settimane in frigorifero.
  5. Lavare i vetrini in una vaschetta Coplin contenente etanolo all'85%, successivamente lavare in una vaschetta Coplin contenente etanolo al 70%; 5 minuti ogni lavaggio.
  6. Incubare i vetrini in 2X SSC per 15-60 min
  7. Procedere con il pretrattamento seguito dalla FISH.
 
 
 
 
Procedura di pretrattamento
  1. Incubare i vetrini in 2 X SSC a 37ºC per 10 min.
  2. Incubare i vetrini in soluzione di lavoro di pepsina a 37ºC per 13 min.
  3. Incubare in PBS 1X per 5 min a temperatura ambiente.
  4. Fissare i vetrini in formaldeide all'1% per 5 min a temperatura ambiente
  5. Lavare i vetrini in PBS 1X per 5 min a temperatura ambiente.
  6. Procedere con la denaturazione dei vetrini secondo il protocollo FISH
 
 
 
 

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