Pretrattamento dei campioni in paraffina

Sono stati preparati in anticipo vetrini per campioni in sezioni in paraffina e sono stati cotti a 56° C. Si procederà con il resto del protocollo di pretrattamento e quindi si eseguiranno le ibridazioni con 17 sonde HER-2/neu /CEP®.

 

Deparaffinazione dei vetrini

Hemo-De è un solvente atossico con proprietà simili a quelle dello xilene e viene usato per sciogliere la paraffina. l'etanolo disidrata il campione e solubilizza la paraffina rimanente, rendendola adatta per il pretrattamento.

____ 1. Immergere i vetrini in Hemo-De per 10 minuti a temperatura ambiente.

____ 2. Ripetere per due volte, utilizzando del nuovo Hemo-De ogni volta.

____ 3. Disidratare i vetrini in EtOH al 100% per 5 minuti a temperatura ambiente.

____ 4. Ripetere il passaggio 3.

____ 5. Asciugare i vetrini all'aria o collocarli su uno scaldavetrini impostato a 45-50° C per 2-5 minuti.

 

Pretrattamento dei vetrini

HCL aiuta a solubilizzare le proteine nucleari basiche, migliorando così l'accessibilità del DNA alle sonde. HCl è anche utilizzato per estrarre le proteine della matrice extracellulare che limitano l'accessibilità della sonda alle cellule e causano autofluorescenza dei tessuti. Il tampone di pretrattamento aiuta nella denaturazione delle proteine e nella rimozione di reticolazioni delle proteine. Questo è importante per consentire una sufficiente digestione della proteasi.

____ 1. Immergere i vetrini in 0,2N HCl per 20 minuti.

____ 2. Immergere i vetrini in acqua purificata per 3 minuti.

____ 3. Immergere i vetrini in tampone di lavaggio per 3 minuti.

____ 4. Immergere i vetrini in soluzione di pretrattamento a 80°C per 30 minuti.

____ 5. Immergere i vetrini in acqua purificata per 1 minuto.

____ 6. Immergere i vetrini in tampone di lavaggio per 5 minuti. Ripetere usando la seconda vaschetta di tampone di lavaggio. 

 

Trattamento dei vetrini con proteasi

La proteasi serve a digerire le proteine del tessuto ed è essenziale per l'accessibilità delle sonde al DNA bersaglio.

____ 1. Rimuovere i vetrini dalla seconda vaschetta del tampone di lavaggio e rimuovere il tampone in eccesso asciugando i bordi dei vetrini con un tovagliolo di carta.

____ 2. Immergere i vetrini in soluzione di proteasi a 37°C per 10 minuti.

____ 3. Immergere i vetrini in tampone di lavaggio per 5 minuti. Ripetere usando la seconda vaschetta di tampone di lavaggio.

____ 4. Asciugare i vetrini su uno scaldavetrini impostato a 45 - 50°C per 2-5 minuti.

 

Fissaggio del campione

Il fissaggio del campione riduce al minimo la perdita di tessuto nella denaturazione e ibridazione.

____ 1. Immergere i vetrini in formalina tamponata al 10% a temperatura ambiente per 10 minuti.

____ 2. Immergere i vetrini in tampone di lavaggio per 5 minuti. Ripetere usando la seconda vaschetta di tampone di lavaggio.

____ 3. Asciugare i vetrini su uno scaldavetrini impostato a 45 - 50°C per 2-5 minuti. Procedere con il protocollo della sonda Vysis LSI®.

 

Denaturazione del campione

____ 1. Posizionare i vetrini nella soluzione di denaturazione preriscaldata a 72°C ± 1°C (<6/vaschetta) per 6 minuti.

____ 2. Disidratare in soluzioni di EtOH al 70%, 85% e 100% per 1 minuto in ciascuna.

____ 3. Asciugare su uno scaldavetrini impostato a 45 - -50°C per 2-5 minuti.

 

Ibridazione

____ 1. Preriscaldare la sonda a temperatura ambiente, agitare e rallentare la rotazione.

____ 2. Aggiungere 10 ml di miscela di sonda sull'area del campione del vetrino.

____ 3. Posizionare un vetrino coprioggetti di 22x22 mm e sigillare i bordi con mastice.

____ 4. Posizionare i vetrini nella camera umidificata preriscaldata con un coperchio stretto in incubatore a 37°C per tutta la notte (14-18 ore).

 

Lavaggio post-ibridazione

____ 1. Aggiungere tampone di lavaggio post-ibridazione a ciascuna delle due vaschette Coplin. Preriscaldare una vaschetta a bagnomaria a 72±1°C e la seconda a temperatura ambiente.

____ 2. Togliere il sigillo di mastice dal vetrino tirando delicatamente verso l'alto il sigillante usando pinze.

____ 3. Immergere il/i vetrino/i nel tampone di lavaggio post-ibridazione a temperatura ambiente e far scivolare il vetrino coprioggetti.

____ 4. Rimuovere il liquido in eccesso pulendo il bordo del vetrino e immergere il vetrino nel tampone di lavaggio post-ibridazione a 72±1°C per 2 minuti (£6 vetrini/vaschetta).

____ 5. Rimuovere il/i vetrino/i dal tampone di lavaggio, asciugare all'aria al buio in posizione verticale.

 

Controcolorazione e conservazione vetrini

____ 1. Applicare 10 µl di colorante di contrasto DAPI II all'area bersaglio del vetrino e applicare un vetrino coprioggetti in vetro. Conservare il/i vetrino/i al buio prima del conteggio del numero dei segnali. O conservare al passaggio successivo.

____ 2. Conservare i vetrini ibridati (con vetrini coprioggetto sopra) a -20°C al buio. Dopo aver rimosso dalla conservazione a -20°C, lasciar raggiungere a/I vetrino/i la temperatura ambiente prima di fare la visualizzazione mediante la microscopia a fluorescenza.

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