Preparazione delle cellule del globulo polare umano

Questa procedura viene eseguita dopo che è stata effettuata la rimozione del globulo polare. Le cellule del globulo polare, prelevate da oociti non fecondati e fecondati, vengono sottoposte a biopsia mediante dissezione meccanica.

Procedura

  1. Preparare un fissativo (metanolo:acido acetico glaciale, 3:1) e conservare in congelatore fino a quando non sarà pronto per essere utilizzato.
  2. Preparare la vaschetta di Coplin contenente metanolo.
  3. Incidere un piccolo cerchio nella parte inferiore di una piastra di Petri da 35 x 10 mm. Il cerchio identifica l'area target in cui posizionare il globulo polare consentendo un più facile trasferimento.
  4. Scrivere l'identificativo del campione e le informazioni pertinenti sull'area smerigliata del vetrino (o dei vetrini) per microscopio. Pulire in precedenza il vetrino strofinando con un fissativo e un panno che non lascia residui.
  5. Riempire un vetrino a goccia pendente con acqua purificata.
  6. Riscaldare la punta di una pipetta capillare da 25 µl usando una microfiamma e contemporaneamente tirare la punta della pipetta riscaldata per estenderla e creare una punta con un diametro interno di 50 µm. Assicurarsi che l'estensione della punta della pipetta presenti un'estremità piatta in modo che non sia tagliente. Una punta tagliente può danneggiare il globulo polare. Rompere di nuovo la punta, se necessario, al fine di creare una punta smussata. Le dimensioni dell'apertura della pipetta devono essere controllate prima di prelevare il globulo polare per assicurarsi che sia della dimensione adeguata; se il diametro è troppo grande esiste un rischio maggiore di perdita del globulo polare.
  7. Aspirare una piccola quantità (circa 2 - 3 µl) di acqua nella pipetta.
  8. Usando un microscopio stereo individuare il globulo polare nella piastra di Petri.
  9. Aspirare con delicatezza il globulo polare nella pipetta e trasferirlo sul vetrino a goccia pendente contenente l'acqua. Rilasciare il globulo polare dalla pipetta soffiando delicatamente e posizionarlo quindi all'interno del cerchio centrale del vetrino a goccia pendente.
  10. Togliere il globulo polare dall'acqua aspirandolo nella pipetta ridotta insieme ad una piccola quantità di acqua. Trasferire la cellula in un vetrino per microscopio con una piccola quantità di acqua. Incidere un cerchio sulla parte superiore del vetrino intorno alla goccia di acqua con un incisore con punta in carburo.
  11. Consentire al globulo polare di asciugarsi nella goccia di acqua sul vetrino mentre lo si osserva costantemente al microscopio invertito. Quando asciutto, aspirare una piccola quantità di fissativo (da 2 a 3 µl circa) nella stessa pipetta attenuata e rilasciare il fissativo sul globulo polare.

    Nota: Quando il globulo polare viene sottoposto a fissaggio per la prima volta dopo 6 ore dal recupero, versare alcune gocce di fissativo appena prima che l'asciugatura sia completata al fine di rimuovere tutto il citoplasma.
  12. Posizionare un'altra goccia di fissativo dalla pipetta attenuata sulla cellula prima della completa asciugatura a meno che non sia evidente che la dissoluzione del citoplasma è già avvenuta. Ripetere questa operazione fino a quando il citoplasma che circonda la cellula non si sia dissolto lasciando solo il nucleo (applicare il fissativo almeno 5 volte).

    Nota: La rimozione completa del citoplasma è essenziale per una ottimale ibridazione della sonda.
  13. Utilizzando il marcatore, disegnare due cerchi intorno alla cromatina sul lato superiore del vetrino. Un cerchio viene disegnato leggermente più grande dell'altro cerchio, cioè un cerchio è all'interno dell'altro con la cellula nel centro del cerchio più piccolo. Il cerchio inciso attorno alla cellula consentirà di localizzare più facilmente la stessa dopo la procedura di ibridazione.
  14. Posizionare il vetrino nella vaschetta Coplin contenente metanolo per 5 minuti.
  15. Rimuovere il vetrino dal metanolo e lasciare asciugare all'aria.
  16. Utilizzando una scala di Vernier sul tavolino del microscopio, o un vetrino England Finder, individuare e registrare la posizione della cellula sul vetrino per microscopio. Tali coordinate aiuteranno a localizzare la cellula dopo l'ibridazione.
  17. Disegnare un altro cerchio piccolo sul fondo del vetrino per microscopio, intorno alla cellula, usando un pennarello indelebile. In questo modo si definisce la zona in cui applicare la sonda.

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