Pretrattamento in paraffina 3

Il protocollo di versione breve non deve sostituire il foglietto illustrativo.

Destinazione d'uso
Preparazione di sezioni di tessuto incluse in paraffina e fissate su vetrini a carica positiva da utilizzare nell'ibridazione fluorescente in situ (FISH) con sonde DNA multicolore per FISH Vysis. 

Sintesi e principio
La procedura che segue è stata concepita per ottimizzare la lavorabilità dei tessuti e la permeabilità per FISH quando si utilizzano sonde DNA multicolore per FISH Vysis (es., ProVysionTM Multi-colorProbe, Ordine n. 32-131090). Questo test di pretrattamento consentirà di ridurre al minimo il particolato pesante di fondo dopo l'ibridazione della sonda DNA, che a volte può verificarsi in determinate tipologie di tessuti.

Preparazione dei vetrini di campioni
Nota: Utilizzare campioni che sono stati fissati in formalina per un arco di tempo tra 24-48 ore.

1. Tagliare sezioni di paraffina dello spessore di 4 - 5 µm servendosi di un microtomo.
2.  Immergere le sezioni in bagnomaria purificato (ovvero, sottoposto a distillazione per tre volte) a 40ºC.
3. Montare la sezione su un vetrino caricato positivamente.
4. Asciugare all'aria i vetrini e cuocere per tutta la notte a 56ºC.

Deparaffinazione dei vetrini

1. Immergere i vetrini in Hemo-De per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Ripetere il passaggio 1 per due volte, utilizzando del nuovo Hemo-De ogni volta.
3. Disidratare i vetrini in EtOH al 100% per 1 minuto a temperatura ambiente. Ripetere l'operazione.
4. Far asciugare i vetrini all'aria per 2-5 minuti, se lo si desidera.

Pretrattamento proteasi/vetrino

1. Immergere i vetrini in ambiente acido formico al 45%/perossido di idrogeno al 0,3% per 15 minuti.
2. Immergere i vetrini in acqua purificata per 3 minuti. Rimuovere l'acqua in eccesso asciugando i bordi dei vetrini con un tovagliolo di carta.
3. Immergere i vetrini in soluzione di pretrattamento a 80°C per 10 minuti.
4. Sciacquare in acqua purificata fresca per 3 minuti.
5. Incubare in soluzione di lavoro di proteasi a 37°C per 10 minuti. Misurare 50 ml (Exact) del tampone di proteasi III e posizionarlo a bagnomaria di 37±1°C. Accertarsi che la temperatura del tampone sia di 37 ±1°C, e prima dell'uso. Preparare una soluzione stock di proteasi aggiungendo 9,0 mg (una provetta) di proteasi a 515 µl di acqua purificata.
   
   Per fare la soluzione di lavoro di proteasi
   Versare con una pipetta 100 µl di soluzione stock di proteasi in (volume riscaldato e attentamente misurato) flacone da 50 ml di tampone di proteasi III. Congelare la rimanente soluzione stock di proteasi.
6. Arrestare la reazione incubando in soluzione stock di proteasi per 3 minuti.
7. Sciacquare in acqua purificata fresca per 3 minuti.
8. Far asciugare i vetrini all'aria per 2-5 minuti.
9. Procedere secondo l'apposito protocollo della sonda Vysis.