Pretrattamento in paraffina 2

Il protocollo di versione breve non deve sostituire il foglietto illustrativo.

Destinazione d'uso

Preparazione di sezioni di tessuto incluse in paraffina fissate su vetrini a carica positiva da utilizzare nell'ibridazione fluorescente in situ (FISH) con sonde DNA multicolore per FISH Vysis.

Sintesi e principio

La procedura che segue è stata progettata per massimizzare la permeabilità del tessuto per la FISH quando si utilizzano sonde DNA multicolore FISH Vysis.

Reagenti forniti in kit Ordine del kit n. 32-801210 Per uso in laboratorio

Reagente Quantità Composizione Conservazione
Soluzione di pretrattamento 5 x 50 ml Tiocianato di sodio (NaSCN) 2 - 25°C
Tampone proteasi II 5 x 62,5 ml 0,2 N HCl, pH 1,0 2 - 25°C
Proteasi 5 x 250 mg 2500 - 3000 U/mg proteasi, liofilizzata -20 - 8 °C

Attrezzature necessarie ma non fornite

  • Etanolo assoluto (EtOH)
  • Agente solvente Hemo-De (Scientific Safety Solvents Cat. n. HD-150)
  • Acqua purificata (acqua distillata o deionizzata)
  • Vaschette Coplin (16 vetrini / 8 capacità di alloggiamento)
  • Bagnomaria a 37 °C e 80 °C (uno a 73°C per l'analisi della sonda)

 

Preparazione dei vetrini dei campioni

Nota: Utilizzare campioni che sono stati fissati in formalina per un arco di tempo tra 24-48 ore.

  1. Tagliare sezioni di paraffina dello spessore di 4 - 5 µm servendosi di un microtomo.
  2. Immergere le sezioni in bagnomaria purificato (ovvero, sottoposto a distillazione per tre volte) a 40ºC.
  3. Montare una sezione su un vetrino caricato positivamente.
  4. Far asciugare i vetrini all'aria.
  5. Cuocere i vetrini per tutta la notte a 56ºC.

 

Deparaffinazione dei vetrini

  1. Immergere i vetrini in Hemo-De per 5 minuti a temperatura ambiente.
  2. Ripetere il passaggio 1 (uno) per due volte, utilizzando del nuovo Hemo-De ogni volta.
  3. Disidratare i vetrini in EtOH al 100% per 1 minuto a temperatura ambiente. Ripetere l'operazione.
  4. Far asciugare i vetrini all'aria per 2-5 minuti, se lo si desidera.

 

Pretrattamento dei vetrini

  1. Immergere i vetrini in soluzione di pretrattamento a 80ºC per 10 minuti. Se necessario, è possibile posizionare due vetrini uno contro l'altro in ciascun alloggiamento della vaschetta Coplin, inserendo un solo vetrino negli alloggiamenti alle due estremità. Per quanto riguarda i vetrini posti alle due estremità, il lato del vetrino contenente la sezione di tessuto deve essere rivolto verso l'interno della vaschetta.
  2. Immergere i vetrini in acqua purificata per 3 minuti.

 

Pretrattamento della proteasi

  1. Rimuovere i vetrini dalla vaschetta di acqua purificata.
  2. Rimuovere l'acqua in eccesso asciugando i bordi dei vetrini con un tovagliolo di carta.
  3. Immergere i vetrini in soluzione di proteasi a 37ºC per 15 minuti. (Accertarsi che la temperatura del tampone sia di 37±1°C prima di aggiungere 250 mg (una provetta) di proteasi. Se necessario, è possibile posizionare due vetrini uno contro l'altro in ciascun alloggiamento della vaschetta Coplin, inserendo un solo vetrino negli alloggiamenti alle due estremità. Per quanto riguarda i vetrini posti alle due estremità, il lato del vetrino contenente la sezione di tessuto deve essere rivolto verso l'interno della vaschetta.
  4. Immergere i vetrini in acqua purificata per 3 minuti.
  5.  Far asciugare i vetrini all'aria per 2-5 minuti.

 

Fissaggio del campione

Nota: Il fissaggio del campione viene eseguito per ridurre al minimo la perdita di tessuto durante la denaturazione del campione. Questa procedura è altamente raccomandata quando i campioni vengono trattati in un bagno di denaturazione.

  1. Riempire 1 (una) vaschetta Coplin con 50 ml di formalina tamponata al 10%. Riempire altre 3 (tre) vaschette Coplin con 50 ml di etanolo al 70%, di etanolo all'85% e di etanolo al 100% in ciascuna.
  2. Immergere i vetrini in formalina tamponata al 10% a temperatura ambiente per 10 minuti.
  3. Immergere i vetrini in acqua purificata per 3 minuti.
  4. Lasciare asciugare i vetrini all'aria.
  5. Procedere secondo l'apposito protocollo della sonda Vysis.

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