Pretrattamento in paraffina

Il protocollo di versione breve non deve sostituire il foglietto illustrativo.

Destinazione d'uso

Preparazione di sezioni di tessuto incluse in paraffina fissate su vetrini a carica positiva da utilizzare nell'ibridazione fluorescente in situ (FISH) con sonde Vysis.

Reagenti forniti

Reagente Quantità Composizione Conservazione
Soluzione di pretrattamento 5 x 50 ml Tiocianato di sodio (NaSCN) 2 - 25°C
Tampone proteasi 5 x 50 ml NaCl, pH 2,0 2 - 25°C
Tampone di lavaggio 5 x 250 mg 2X SSC, pH 7,0 2 - 25°C
Proteasi 5 x 25 mg 2500 - 3000 U/mg proteasi, liofilizzata -20°C

Preparazione dei vetrini di campioni (facoltativo)

Nota: Utilizzare campioni che siano stati fissati in formalina per un arco di tempo compreso tra 24 - 48 ore.

  1. Tagliare sezioni di paraffina dello spessore di 4 - 5 µm servendosi di un microtomo.
  2. Immergere le sezioni in bagnomaria purificato (ovvero sottoposto a distillazione per tre volte) a 40°C.
  3. Montare una sezione su un vetrino caricato positivamente.
  4. Far asciugare i vetrini all'aria.
  5. Far cuocere i vetrini durante la notte a 56°C.

Deparaffinazione dei vetrini

  1. Immergere i vetrini in Hemo-De per 10 minuti a temperatura ambiente.
  2. Ripetere il passaggio 1 per due volte, utilizzando del nuovo Hemo-De ogni volta.
  3. Disidratare i vetrini in EtOH al 100% per 5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere l'operazione.
  4. Asciugare i vetrini all'aria o collocarli su uno scaldavetrini impostato a 45 - 50°C per 2 - 5 minuti.

Pretrattamento dei vetrini

  1. Immergere i vetrini in 0,2N HCl per 20 minuti.
  2. Immergere i vetrini in acqua purificata per 3 minuti.
  3. Immergere i vetrini in tampone di lavaggio per 3 minuti.
  4. Immergere i vetrini in soluzione di pretrattamento a 80°C per 30 minuti. È possibile posizionare due vetrini, messi uno contro l'altro, in ciascun alloggiamento della vaschetta Coplin, inserendo un solo vetrino negli alloggiamenti alle due estremità. Per quanto riguarda i vetrini posti alle due estremità, il lato del vetrino contenente la sezione di tessuto deve essere rivolto verso l'interno della vaschetta. 
  5. Immergere i vetrini in acqua purificata per 1 minuto.
  6. Immergere i vetrini in tampone di lavaggio per 5 minuti. Ripetere usando la seconda vaschetta di tampone di lavaggio.

Trattamento dei vetrini con proteasi

  1. Rimuovere i vetrini dalla seconda vaschetta di tampone di lavaggio.
  2. Rimuovere il tampone in eccesso asciugando i bordi dei vetrini con un tovagliolo di carta.
  3. Immergere i vetrini in soluzione di proteasi a 37°C per 10 minuti. (Accertarsi che la temperatura del tampone sia di 37 ±1°C prima di aggiungere 25 mg [una provetta] di proteasi.)
  4. Immergere i vetrini in tampone di lavaggio per 5 minuti. Ripetere usando la seconda vaschetta di tampone di lavaggio.
  5. Asciugare i vetrini su uno scaldavetrini impostato a 45 - 50°C per 2 - 5 minuti.

Fissaggio del campione

  1. Immergere i vetrini in formalina tamponata al 10% a temperatura ambiente per 10 minuti.
  2. Immergere i vetrini in tampone di lavaggio per 5 minuti. Ripetere usando la seconda vaschetta di tampone di lavaggio.
  3. Asciugare i vetrini su uno scaldavetrini impostato a 45 - 50°C per 2 - 5 minuti.
  4. Procedere secondo l'apposito protocollo della sonda Vysis.

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