Kit per la traslazione del nick: Preparazione dei reagenti

Kit per la traslazione del nick: Preparazione dei reagenti

 

0,2 mM SpectrumGreen, SpectrumOrangeTM o 

Aggiungere 10 µl di 1 mM dUTP a 40 µ di acqua libera da nucleasi.

 

0,1 mM dTTP

Aggiungere 10 µl di 0,3 mM dTTP a 20 µl di acqua libera da nucleasi.

 

Miscela 0,1 mM dNTP

Mescolare insieme 10 µl ciascuno di 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP e 0,3 mM dGTP.

 

DNA estratto da P1, BAC o YAC

Preparare una soluzione di 0,2µ g/µ-1µ g/µ di DNA estratto in tampone Tris-EDTA (Tris a 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,5). 

 
 
 
 
Kit per la traslazione del nick: Procedura del saggio

Questa procedura marca circa 1 µg di DNA estratto da P1, BAC, o YAC. Questo è sufficiente per dieci esperimenti FISH (un'area target pari a 22 mm x 22 mm). 

  1. Collocare una provetta per microcentrifuga su ghiaccio e lasciarla raffreddare.
  2. Aggiungere alla provetta questi componenti nell'ordine elencato. Centrifugare e agitare brevemente su vortex la provetta prima di aggiungere l'enzima (ultimo componente):
    nick-translation-assay-procedure-chart.gif
  3. Centrifugare brevemente e agitare su vortex la provetta.
  4. Incubare per 8 - 16 ore a 15 °C.
  5. Arrestare la reazione riscaldando a bagnomaria a 70 °C per 10 minuti.
  6. Raffreddare su ghiaccio.

Determinare la dimensione della sonda

Determinare la dimensione della sonda è una parte essenziale della procedura di marcatura. Per istruzioni dettagliate sulla preparazione ed esecuzione di un gel di agarosio vedere (1)Maniatis T, Fritsch EF e Sambrook J. Gel electrophoresis of DNA. In: Molecular cloning: a laboratory manual. 2a ed. Cold Spring, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 o (2) Ausubel FM, ed. Preparation and Analysis of DNA. In: Current Protocols in Molecular Biology. New York: Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, 1989.

 

NOTA: A causa della struttura isomerica dei fluorofori, il dUTP non incorporato appare sul gel di agarosio come due domini a differente luminosità. La struttura chimica e la carica netta dei diversi fluorofori influenzano il modello di migrazione su gel. Per esempio, lo SpectrumGreenTM dUTP non incorporato migra verso la parte superiore del gel, mentre lo SpectrumOrangeTM e lo SpectrumRedTM dUTP migrano ulteriormente verso la parte inferiore del gel e possono sovrapporsi allo striscio della sonda DNA. In questo caso, è necessario rimuovere il dUTP non incorporato mediante precipitazione con etanolo e/o filtrazione con gel del DNA della sonda marcata prima di caricare un campione del DNA della sonda sul gel di agarosio per misurarne le dimensioni.

 

Se si aumenta la quantità di enzima e il tempo di incubazione, la distribuzione delle dimensioni si sposta verso frammenti di sonda progressivamente più piccoli. Per la produzione di frammenti di sonda piccoli utilizzare le seguenti condizioni che sono elencate in ordine di dimensioni decrescenti del frammento:

 

5 µl di miscela enzimatica/8 ore di incubazione, 5 µl di miscela enzimatica/16 ore di incubazione, 10 µl di miscela enzimatica/8 ore di incubazione e 10 µl di miscela enzimatica/16 ore di incubazione. Regolare la quantità di acqua libera da nucleasi aggiunta per mantenere il volume totale della reazione a 50 µl.

 
 
 
 
Esecuzione della FISH con sonda marcata

Il seguente è un protocollo consigliato per l'ibridazione di sonde a sequenza univoca su linfociti Potrebbe essere necessario modificare la procedura a seconda del tipo e della dimensione della sonda.

 

Precipitazione della sonda

  1. Versare con una pipetta 5 µl (~100 ng di sonda) della miscela di reazione per la traslazione del nick in una provetta per microcentrifuga.
  2. Aggiungere nella provetta 1 µg di DNA COT-1, 2 µg di DNA placentare umano e 4 µl di acqua purificata.
  3. Aggiungere 1,2 µl (0,1 volume) di 3 M acetato di sodio, poi aggiungere 30 µl (2,5 volumi) di EtOH al 100% per precipitare il DNA. Agitare brevemente su vortex e porre su ghiaccio secco per 15 minuti.
  4. Centrifugare a 12.000 giri/minuto per 30 minuti a 4 °C per formare pellet di DNA.
  5. Rimuovere il surnatante e asciugare il pellet per dieci - quindici minuti sotto vuoto a temperatura ambiente.
  6. Risospendere il pellet in 3 µl di acqua purificata e 7 µl di tampone di ibridazione.
  7. Denaturare la sonda riscaldando la miscela della sonda per 5 minuti a bagnomaria a 73°C.

 

Ibridazione della sonda sulla metafase target

  1. Contrassegnare le zone di ibridazione sul vetrino utilizzando un marcatore a punta.
  2. Assicurarsi che la temperatura della soluzione di denaturazione (formammide al 70% in 2X SSC, pH 7,0 - 8,0) sia a 75 °C. Immergere il vetrino contenente normali cromosomi in metafase nella soluzione per 5 minuti.
  3. Disidratare il vetrino per 1 minuto in EtOH al 70%, successivamente per 1 minuto in EtOH all'85% e per 1 minuto in EtOH al 100%.
  4. Asciugare il vetrino toccando il bordo inferiore con un foglio di carta assorbente e strofinando il lato inferiore con un tovagliolo di carta.
  5. Posizionare il vetrino su uno scalda vetrini a 45 - 50 °C per consentire all'EtOH rimanente di evaporare.
  6. Applicare 10 µl della miscela della sonda denaturata sul vetrino.
  7. Applicare immediatamente il vetrino coprioggetti e sigillare con mastice.
  8. Porre il vetrino in un contenitore umido e sigillato e posizionarlo in un incubatore a 37 °C per 16 ore per l'ibridazione.

 

Lavaggio del vetrino

  1. Posizionare il contenitore che ha la soluzione di lavaggio 0,4X SSC/0,3% NP-40 a bagnomaria a 73 ± 1 °C per almeno trenta minuti prima dell'uso. Eliminare dopo 1 giorno di utilizzo. Preparare un secondo contenitore di 2X SSC/0,1% NP-40 a temperatura ambiente.
  2. Rimuovere il sigillo in mastice e il vetrino coprioggetti e porre immediatamente il vetrino nella soluzione di lavaggio 0,4X SSC/0,3% NP-40 a 73 ± 1 °C. Agitare il vetrino per 1 - 3 secondi.
  3. Ripetere il passo 2 per ogni vetrino - non lavare più di quattro vetrini alla volta - e poi lasciare riposare i vetrini per 2 minuti.
  4. Porre il vetrino nella soluzione di lavaggio 2X SSC/0,1% NP-40 a temperatura ambiente. Agitare il vetrino per 1 - 3 secondi e poi lasciare riposare da 5 secondi a 1 minuto.
  5. Lasciare asciugare il vetrino all'aria e al buio.

Visualizzazione dell'ibridazione

Applicare 10 µl di colorante di contrasto DAPI II e un vetrino coprioggetto per ciascuna posizione di ibridazione.

 
 
 
 

You are about to exit the Abbott family of websites for a 3rd party website

Links which take you out of Abbott worldwide websites are not under the control of Abbott, and Abbott is not responsible for the contents of any such site or any further links from such site. Abbott is providing these links to you only as a convenience, and the inclusion of any link does not imply endorsement of the linked site by Abbott. The website that you have requested also may not be optimised for your screen size.

Do you wish to continue and exit this website?

Yes No

You are about to enter an Abbott country or region specific website.

Please be aware that the website you have requested is intended for the residents of a particular country or countries, as noted on that site. As a result, the site may contain information on pharmaceuticals, medical devices and other products or uses of those products that are not approved in other countries or regions.

Do you wish to continue and enter this website?

Yes No

You are about to enter an Abbott country or region specific website.

Please be aware that the website you have requested is intended for the residents of a particular country or countries, as noted on that site. As a result, the site may contain information on pharmaceuticals, medical devices and other products or uses of those products that are not approved in other countries or regions.

Do you wish to continue and enter this website?

Yes No