MultiVysion® PB: reagenti necessari

MultiVysion® PB: reagenti necessari

Il protocollo di versione breve non deve sostituire il foglietto illustrativo.

 

Le sonde sono premiscelate nel tampone di ibridazione.  Vengono utilizzati 3 µl per ogni area target. 

 

Nota: Il tempo massimo di ibridazione consigliato è di 8 ore, ma 4 ore è comunque un tempo ottimale. Tempi di ibridazione più lunghi possono determinare un'elevata colorazione dei nuclei che può annullare i segnali della sonda.

 

Reagenti per uso generico necessari ma non forniti. 

multivysion-pb-reagents-required.gif

 

Consulta la sezione relativa alla preparazione del campione per un protocollo sulla preparazione di blastomeri umani per la FISH.

 
 
 
 
Visualizzazione dei risultati

Una visualizzazione e un'analisi appropriate dell'ibridazione MultiVysion® sono strettamente correlate all'utilizzo del giusto set di filtri e al corretto allineamento del microscopio a fluorescenza. Alcuni dei set di filtri necessari per la visualizzazione o l'imaging dei risultati di MultiVysion PB potrebbero non essere disponibili nel vostro laboratorio. Contattate il Servizio di assistenza tecnica Vysis per ulteriori informazioni sulle specifiche dei set di filtri. Tutti i set di filtri sono disponibili tramite Vysis, Inc. 

 

Per la visualizzazione dei risultati di MultiVysion PB si raccomanda di disporre come minimo dei seguenti set di filtri:

 

1) Set a banda passante doppia blu/aqua

 

2) Set a banda passante doppia verde/rosso

 

3) Set a banda passante singola oro (giallo)

 

4) Set a banda passante singola aqua v2 (facoltativo, per chiarire i segnali osservati con il set a banda passante doppia blu/aqua quando si ha difficoltà a distinguere i segnali di sonda blu e aqua)

 

Visualizzare i risultati dell'ibridazione nel modo seguente:

  1. Individuare la cellula bersaglio sotto contrasto di fase e a basso ingrandimento (100X), utilizzando le coordinate registrate in precedenza.
  2. Una volta che la cellula è stata localizzata, senza spostare il tavolino del microscopio, passare alla luce fluorescente utilizzando il set di filtri a banda passante singola aqua e rilocalizzare la cellula con basso ingrandimento (100X). Quando la cellula è stata rilocalizzata con la fluorescenza, passare a un ingrandimento ad alta potenza (1000X) per analizzarla. Seguire la sequenza di visualizzazione A o B a seconda del set di filtri che verrà utilizzato per l'analisi. 

A. Se si utilizza il set di filtri a banda passante doppia aqua/blu per l'analisi delle sonde marcate con SpectrumAquaTM e SpectrumBlueTM, procedere alla localizzazione e all'analisi come descritto di seguito: 

    • Localizzare la cellula utilizzando il set di filtri a banda passante doppia aqua/blu.
    • Analizzare ognuna delle altre sonde utilizzando la seguente sequenza di filtri:

1) a banda passante doppia aqua/blu

 

2) a banda passante doppia verde/rosso

 

3) a banda passante singola oro (giallo)

 

Nota: Si raccomanda di eseguire la visualizzazione o l'imaging del campione con questa sequenza, al fine di ridurre al minimo l'entità del fotosbiancamento. Seguendo questa sequenza, i fluorofori più sensibili vengono esposti alla luce per primi.

 

B. Se per l'analisi viene utilizzato un set di filtri a banda passante singola, procedere alla localizzazione e all'analisi come descritto di seguito:

    • Localizzare la cellula utilizzando il set di filtri a banda passante singola aqua/blu.
    • Analizzare ognuna delle altre sonde utilizzando la seguente sequenza di filtri:

1) a banda passante singola blu

 

2) a banda passante singola rosso

 

3) a banda passante singola oro (giallo)

 

4) a banda passante singola verde 

 

5) a banda passante singola aqua

 
 
 
 

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