Preparazione dei linfociti: Preparazione della coltura

Preparazione dei linfociti: Preparazione della coltura
  1. Aspirare 8 - 10 ml di sangue periferico in una provetta vacutainer da 10 ml con tappo verde contenente sodio eparina come conservante. Mescolare bene.
  2. Trasferire asetticamente il contenuto della provetta vacutainer in una provetta per centrifuga da 15 ml.
  3. Centrifugare il campione a 2000 giri/minuto per 10 minuti in una centrifuga da banco.
  4. Rimuovere delicatamente lo strato di plasma usando una pipetta Pasteur. Smaltire lo strato di plasma seguendo le procedure del proprio laboratorio per lo smaltimento del materiale biologico.
  5. Rimuovere il buffy-coat aggirando lo strato con attenzione e al contempo aspirando i leucociti in una pipetta Pasteur. Saranno aspirati anche eritrociti e plasma; ridurre al minimo il numero di eritrociti inclusi.
  6. Espellere il buffy-coat in una provetta per centrifuga da 15 ml contenente 1,5 ml di cRPMI.
  7. Aliquotare un volume adeguato di sospensione di leucociti in fiasche da 25 cm2 contenenti 10 ml di cRPMI. 
  8. Aggiungere 0,2 ml di PHA in ciascuna fiasca; stringere il tappo e poi allentarlo leggermente per consentire alla CO2 di penetrare nella fiasca.
  9. Incubare la coltura:

per l'utilizzo nella preparazione dei vetrini per la FISH...

Questo metodo genera cromosomi con una risoluzione di bandeggio di 400 - 450 bande ed è sufficiente per la maggior parte delle applicazioni della FISH. 

    • Incubare la coltura a 37 ±1°C, in ambiente al 5% di CO2 per 72 - 96 ore.

per l'utilizzo nella preparazione dei vetrini per la CGH...

Questi passaggi aggiuntivi aumentano l'allungamento dei cromosomi e l'indice mitotico. Per la CGH, i cromosomi devono avere una risoluzione di bandeggio di 400 - 550 bande.

    • Incubare la coltura a 37 ±1°C, in ambiente al 5% di CO2 per 48 - 72 ore.
    • Aggiungere 0,2 ml di soluzione di timidina a ogni fiasca e mescolare delicatamente.
    • Incubare la coltura per 14 - 18 ore.
    • Trasferire la coltura in una provetta per centrifuga da 15 ml.
    • Centrifugare a 1000 giri/minuto per 10 minuti.
    • Decantare il surnatante e aggiungere 10 ml di PBS.
    • Centrifugare a 1000 giri/minuto per 10 minuti.
    • Decantare il surnatante e aggiungere 10 ml di cRPMI in ciascuna provetta.
    • Incubare la coltura per 4 - 5 ore.
 
 
 
 
Raccolta della coltura
  1. Aspirare 8 - 10 ml di sangue periferico in una provetta vacutainer da 10 ml con tappo verde contenente sodio eparina come conservante. Mescolare bene.
  2. Trasferire asetticamente il contenuto della provetta vacutainer in una provetta per centrifuga da 15 ml.
  3. Centrifugare il campione a 2000 giri/minuto per 10 minuti in una centrifuga da banco.
  4. Rimuovere delicatamente lo strato di plasma usando una pipetta Pasteur. Smaltire lo strato di plasma seguendo le procedure del proprio laboratorio per lo smaltimento del materiale biologico.
  5. Rimuovere il buffy-coat aggirando lo strato con attenzione e al contempo aspirando i leucociti in una pipetta Pasteur. Saranno aspirati anche eritrociti e plasma; ridurre al minimo il numero di eritrociti inclusi.
  6. Espellere il buffy-coat in una provetta per centrifuga da 15 ml contenente 1,5 ml di cRPMI.
  7. Aliquotare un volume adeguato di sospensione di leucociti in fiasche da 25 cm2 contenenti 10 ml di cRPMI.
  8. Aggiungere 0,2 ml di PHA in ciascuna fiasca; stringere il tappo e poi allentarlo leggermente per consentire alla CO2 di penetrare nella fiasca.
  9. Incubare la coltura:

per l'utilizzo nella preparazione dei vetrini per la FISH...

Questo metodo genera cromosomi con una risoluzione di bandeggio di 400 - 450 bande ed è sufficiente per la maggior parte delle applicazioni della FISH. 

    • Incubare la coltura a 37 ±1°C, in ambiente al 5% di CO2 per 72 - 96 ore.

per l'utilizzo nella preparazione dei vetrini per la CGH... 

Questi passaggi aggiuntivi aumentano l'allungamento dei cromosomi e l'indice mitotico. Per la CGH, i cromosomi devono avere una risoluzione di bandeggio di 400 - 550 bande.

    • Incubare la coltura a 37 ±1°C, in ambiente al 5% di CO2 per 48 - 72 ore.
    • Aggiungere 0,2 ml di soluzione di timidina a ogni fiasca e mescolare delicatamente.
    • Incubare la coltura per 14 - 18 ore.
    • Trasferire la coltura in una provetta per centrifuga da 15 ml.
    • Centrifugare a 1000 giri/minuto per 10 minuti.
    • Decantare il surnatante e aggiungere 10 ml di PBS.
    • Centrifugare a 1000 giri/minuto per 10 minuti.
    • Decantare il surnatante e aggiungere 10 ml di cRPMI in ciascuna provetta.
    • Incubare la coltura per 4 - 5 ore. 
 
 
 
 
Fissaggio del campione
  1. Aggiungere lentamente 2 ml di fissativo Carnoy all'interno di ciascuna provetta per centrifuga.
  2. Picchiettare delicatamente la provetta per centrifuga per miscelare la sospensione del pellet cellulare con il fissativo.
  3. Aggiungere lentamente altri 6 ml di fissativo Carnoy a ogni provetta.
  4. Tappare bene tutte le provette e mescolare capovolgendole più volte. 
  5. Lasciare riposare la sospensione per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare a 1000 giri/minuto per 10 minuti.
  6. Aspirare il surnatante fino alla tacca da 1,5 ml della provetta per centrifuga, avendo cura di evitare il pellet cellulare
  7. Picchiettare delicatamente la provetta per centrifuga al fine di separare il pellet.
  8. Eseguire i seguenti passaggi per tre volte:
    • Aggiungere lentamente 10 ml di fissativo Carnoy in ciascuna provetta per centrifuga.
    • Tappare bene tutte le provette e mescolare capovolgendole. 
    • Centrifugare la sospensione a 1000 giri/minuto per 10 minuti.
    • Aspirare il surnatante fino alla tacca da 1,5 ml della provetta per centrifuga, avendo cura di evitare il pellet cellulare.
    • Picchiettare delicatamente la provetta per centrifuga al fine di separare il pellet.
  9. Aggiungere lentamente del fissativo Carnoy a ciascuna sospensione fino a produrre una sospensione leggermente torbida, e miscelare delicatamente.

 

Nota: È necessario continuare ad aggiungere fissativo al pellet cellulare fino a quando la sospensione non diverrà leggermente torbida; la quantità di fissativo necessaria dipenderà dalle dimensioni del pellet cellulare. 

 

Le cellule possono essere conservate a 4°C in provette per centrifuga ben tappate fino a quando non saranno pronte da utilizzare. Se i vetrini non vengono preparati entro 7 GIORNI, portare il volume totale a 10 ml e conservare a -20°C. Ripetere il lavaggio descritto nei passaggi 8a - 8e due volte prima di preparare i vetrini.

 
 
 
 

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