Reagenti per attrezzature del laboratorio

Attrezzature da laboratorio - Reagenti

Materiali necessari

 

I seguenti materiali ausiliari, reagenti e apparecchiature sono necessari per eseguire i test FISH.

  • Etanolo al 100% (EtOH)
  • acqua purificata (distillata o deionizzata)
  • HCl 12N (per la regolazione del pH di soluzioni di lavaggio)
  • 1N NaOH (per la regolazione del pH di soluzioni di lavaggio)
  • 20X SSC (500 g) (Vysis ordine n. 32-804850)
  • NP-40 (Vysis ordine n. 32-804818)
  • Vaschette Coplin in vetro
  • Termometro calibrato
  • Colorante di contrasto DAPI (Vysis ordine n. 30-804830)
  • Colorante di contrasto DAPI II (Vysis ordine n. 30-804831)
  • Pinze
  • Formammide, grado ultrapura (Vysis ordine n. US75828)
  • Cilindro graduato da 1000 ml
  • Agitatore magnetico
  • Metanolo (per far scorrere la preparazione)
  • Microcentrifuga
  • Puntali di micropipette per 1-10 µl volumi
  • Micropipetta per capacità di 1-10 µl
  • Misuratore di pH
  • Vetrini prelavati in vetro per microscopio
  • Acqua purificata
  • Timer
  • Miscelatore vortex
  • Bagnomaria (37 e 72°C)

Reagenti di pretrattamento

  • Kit di pretrattamento I Paraffina (32-801200)
  • Kit di pretrattamento II Paraffina (32-801210)
  • Kit di pretrattamento III Paraffina (32-801230)

  

 
 
 
 
Preparazione dei reagenti

Nota: Dove indicato, misurare il pH di queste soluzioni a temperatura ambiente. Utilizzare un misuratore di pH con un elettrodo di vetro a meno che non altrimenti specificato.

 

Soluzione 20X SSC

 

Mescolare accuratamente 132g 20X SSC in 400 ml H2O purificata. Misurare il pH e regolare a pH 5,3 con HCl. Aggiungere H2O purificata per portare il volume finale a 500 ml. Conservare a temperatura ambiente. Gettare la soluzione in stock dopo 6 mesi o prima se la soluzione appare torbida o contaminata.

 

 Soluzione 2X SSC

 

Mescolare accuratamente 100 ml 20X SSC (pH 5,3) con 850 ml H2O purificata. Misurare il pH e regolare a pH 7,0 ± 0,2 con NaOH. Aggiungere H2O purificata per portare il volume finale a 1 litro. Conservare a temperatura ambiente. Gettare la soluzione in stock dopo 6 mesi o prima se la soluzione appare torbida o contaminata.

 

Soluzione di denaturazione (Formammide 70%/2X SSC)

 

Mescolare accuratamente 49 ml di formammide ultrapura, 7 ml 20X SSC (pH 5,3) e 14 ml H2O purificata in una vaschetta Coplin in vetro. Misurare il pH utilizzando strisce indicatrici pH per verificare che il pH sia 7,0-8,0. Tra gli impieghi, conservare in luogo chiuso a 2-8°C. Gettare dopo 7 giorni.

 

0,4X SSC/Soluzione di lavaggio NP-40 al 0,3%

 

Mescolare accuratamente 20 ml 20X SSC (pH 5,3) con 950 ml H2O purificata. Aggiungere 3 ml di NP-40. Mescolare accuratamente fino a quando NP-40 non si scioglie completamente. Misurare il pH e regolare il pH a 7,0-7,5 con NaOH. Aggiungere H2O purificata per portare il volume finale della soluzione a 1 litro. Conservare a temperatura ambiente. Gettare la soluzione in stock dopo 6 mesi o prima se la soluzione appare torbida o contaminata.

 

2X SSC/Soluzione di lavaggio NP-40 allo 0,1%

 

Mescolare accuratamente 100 ml 20X SSC (pH 5,3) con 850 ml H2O purificata. Aggiungere 1 ml di NP-40. Misurare il pH e regolare a pH 7,0 ± 0,2 con NaOH. Aggiungere H2O purificata per portare il volume finale a 1 litro. Conservare a temperatura ambiente. Gettare la soluzione in stock dopo 6 mesi o prima se la soluzione appare torbida o contaminata.

 

Soluzioni di etanolo (70%, 85%, 100%)

 

Preparare diluizioni v/v di di etanolo al 100% con H2O purificata. Tra gli impieghi, conservare al chiuso ermeticamente a temperatura ambiente. Scartare le soluzioni in stock dopo 6 mesi.

 

PBS

 

Preparare PBS diluendo 20 ml di PBS 10X con 180 ml di H2O purificata. Conservare a temperatura ambiente. Gettare la soluzione in stock dopo 6 mesi o prima se la soluzione appare torbida o contaminata.

 

Quantità di Rnasi A e soluzioni di lavoro

 

Preparare una soluzione stock di 10 mg/ ml RNASI A (senza Dnasi) in 2X SSC. Se RNasi non è marcata come libera da Dnasi, posizionare la soluzione Rnasi in bagnomaria bollente per 10 minuti a DNase inattivata. Suddividere in volumi da 10 µl e conservare a -20 °C in provette tappate da 1.0 ml. Al momento dell'utilizzo, preparare la soluzione di Rnasi di lavoro mediante scongelamento della soluzione in stock di Rnasi (10 mg/ml) nella provetta e aggiungendo direttamente 990 µl di 2X SSC pH 7,0-7,4 ai 10 µl contenuti all'interno della provetta. Vortex per mescolare. Non congelare-scongelare. Gettare dopo l'uso.

 

Quantità di pepsina e soluzioni di lavoro

 

Preparare soluzione in stock di pepsina al pepsina 10% mescolando 0,1 g di pepsina in 1 ml di acqua( preriscaldata a 37 °C). Suddividere in volumi di 35 µl e conservare a -20 °C fino a quando non è pronta per l'uso. Quando si è pronti all'uso, preparare soluzione di pepsina di lavoro allo 0,005% mediante miscelazione di 35 µl dello stock di pepsina al 10% in soluzione di 69,3ml di acqua purificata e 0,7 ml di 1,0 N HCl riscaldati a 37º C in vaschetta Coplin (utilizzando bagnomaria a 37°C).

 

Soluzione di fissaggio di formaldeide

 

Mescolare 57,6 ml di acqua purificata, 3,5 ml di 1M MgCl2, 7 ml di 10X PBS e 1,89 ml di formaldeide al 37%. Mescolare bene. Mettere in una vaschetta Coplin. Preparare fresco ogni giorno.

 
 
 
 

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