Pretrattamento per FISH

Il protocollo di versione breve non deve sostituire il foglietto illustrativo.

Destinazione d'uso

Per la preparazione di cellule fissate su vetrini da utilizzare durante l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) con sonde Vysis.

Reagenti forniti

Reagente Quantità Composizione Conservazione
Tampone di pepsina 3 x 50 ml 10 mM HCl 2 - 25°C
Proteasi 3 x 25 mg 2500 - 3000 U/mg proteasi, liofilizzata -20 - 8°C
PBS 2 x 250 ml  PBS 1X 2 - 25°C
100X MgCl2 3 x 0,5 ml 2M MgCl2 * 6 H2O 2 - 25°C
20X SSC 1 x 66 g Cloruro di sodio e Citrato di sodio -25 - 30 C

Reagenti forniti
Materiali necessari ma non forniti

  • Etanolo assoluto (EtOH)
  • Soluzione di formalina tamponata al 10%
  • Fissativo Carnoy (metanolo: acido acetico glaciale [3:1])
  • Acqua purificata (acqua distillata o deionizzata)
  • Vaschette Coplin
  • Provette per centrifuga coniche da 15 ml
  • Provette per microcentrifuga in polipropilene (1,5 ml)
  • Bagnomaria a 37°C

 

Procedura di pretrattamento

  1. Far asciugare completamente il/i vetrino/i a temperatura ambiente.
  2. Immergere il/i vetrino/i in 2X SSC per 2 minuti a 73 ±1°C
  3. Immergere il/i vetrino/i nella soluzione di proteasi per 10 minuti a 37°C (accertarsi che la temperatura del tampone sia di 37°C prima di aggiungere 25 mg - una provetta - di proteasi).
  4. Lavare il/i vetrino/i in PBS 1X per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Fissare i vetrini in formaldeide all'1% per 5 minuti a temperatura ambiente. (Mescolare 12,5 ml di formalina tamponata neutra al 10%, 37 ml di PBS 1X e 0,5 ml di 100X MgCl2 - una provetta).
  6. Lavare i vetrini in PBS 1X per 5 minuti a temperatura ambiente.
  7. Disidratare il/i vetrino/i mediante immersione in soluzione di etanolo al 70% a temperatura ambiente. Lasciare il/i vetrino/i a riposo nel lavaggio con etanolo per 1 minuto. Ripetere l'operazione con la soluzione di etanolo all'85% e poi con quella al 100%.
  8. Procedere secondo l'apposito protocollo della sonda Vysis.

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