FISH su nuclei isolati da paraffina

  • Utile per i campioni che sono stati fissati per periodi di tempo prolungati o per quelli difficili da utilizzare come target per la FISH, come i campioni cerebrali.
  • Deparaffinare una sezione di tessuto di 40 µm con xilene (o Histoclear) 3 volte per 10 minuti ciascuna.
  • Disidratare in EtOH al 100% 2 volte per 5 minuti ciascuna.
  • Incubare in 4 mg/ml di pepsina (Sigma P-7012, in NaCl allo 0,9%, pH 1,5) per 2 ore a 37°C. Miscelare su vortex ogni 30 minuti.
  • Filtrare attraverso una membrana in nylon con pori da 40 µm.
  • Centrifugare a 800 giri/minuto (da banco, standard) per 5 - 10 minuti.
  • Lavare il pellet in PBS, centrifugare 2 volte a 800 giri/minuto per 5 - 10 minuti ciascuna volta.
  • Risospendere il pellet in un minimo volume di PBS.
  • Miscelare su vortex i nuclei, distribuire su vetrini FISHer Superfrost Plus (Cat. # 12-550-15), asciugare i vetrini a 65°C per 10 minuti.
  • Sciacquare il vetrino in PBS.
  • Incubare in Triton X-100 allo 0,01% in PBS per 1,5 minuti.
  • Sciacquare 3 volte in PBS, 3 minuti per volta.
  • Incubare per 5 minuti in 0,3 mg/ml di pronasi in 50 mM Tris/Cl pH 7,6, 5 mM EDTA.
  • Incubare in 2 mg/ml di glicina in PBS 3 volte per 3 minuti ciascuna.
  • Incubare per 5 minuti in paraformaldeide al 4% in PBS.
  • Incubare per 3 minuti in 2 mg/ml di glicina in PBS.
  • Lavare in soluzioni di EtOH al 30%, 60%, 80%, 95% e 100% per 3 minuti in ciascuna.
  • Lasciare asciugare i vetrini all'aria.
  • Denaturare contemporaneamente la sonda e il DNA target per 1 - 3 minuti in forno a 90°C.
  • Incubare a 37°C in una camera umidificata per un arco di tempo variabile tra 1 ora (almeno) e una notte.
  • Lavare per 1 minuto in ciascuna delle seguenti soluzioni di lavaggio a 45°C: 3 volte in formammide al 50%/2X SSC, un lavaggio in ciascuna soluzione di 2X SSC, 2X SSC/NP-40 allo 0,1%, 2X SSC/NP-40 allo 0,1% (RT).
  • Questo protocollo richiede l'utilizzo di formammide e xilene, entrambi teratogeni. Consultare le schede di dati di sicurezza dei materiali (MSDS) per ulteriori informazioni.

 

Protocollo presentato da:

Dott. Rizwan Naaem - Direttore - Cytogenetics Lab

Baystate Medical Center, Springfield, MA 1994

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