Controllo qualità di laboratorio per FISH

In origine, le presenti linee guida sono state scritte per il prodotto vetrino di controllo ProbeChek™, ma sono un ottimo punto di partenza per definire procedure di laboratorio di qualità utilizzando le sonde CEP® o LSI® per l'enumerazione.

Le procedure di ibridazione delle sonde CEP o LSI devono essere eseguite in base alle istruzioni riportate nel foglietto illustrativo fornito con il prodotto sonda. Per un'ibridazione ottimale e una valutazione e interpretazione accurate dei segnali delle sonde CEP e LSI durante l'utilizzo dei vetrini di controllo ProbeChek™, è caldamente raccomandato l'uso di una strumentazione di microscopia a fluorescenza perfettamente funzionante, filtri inclusi, nonché il rispetto delle procedure riportate nei foglietti illustrativi del prodotto sonda. Prima di procedere all'ibridazione, i campioni del test devono essere valutati al microscopio a contrasto di fase, al fine di determinare se ottimali per la FISH. Le linee guida consigliate per i vetrini per la FISH sono indicate di seguito:

  • Le cellule devono essere distribuite in modo uniforme su tutto il vetrino. La presenza di aree con cumuli di cellule è indicativa di una cattiva preparazione del vetrino o del campione. Ci dovrebbe essere un minimo di otto cellule per campo, 400X (ingrandimento totale). Un numero di cellule inferiore a questo è indice di una concentrazione cellulare troppo bassa per un processo di enumerazione ottimale. 
  • Nuclei e cromosomi in metafase non dovrebbero apparire luminosi. Cellule luminose indicano che le condizioni di preparazione del vetrino non sono state ottimali. Fare in modo che le condizioni di preparazione del vetrino siano sempre ottimali utilizzando una preparazioni di linfociti di buona qualità prima di preparare i vetrini.
  • Attorno ai nuclei e alle metafasi non deve essere visibile il citoplasma. Il citoplasma può pregiudicare l'ibridazione e condurre a un'ibridazione inefficiente e a risultati imprecisi.

Ogni vetrino ibridato deve essere valutato in base ai parametri di qualità stabiliti dal laboratorio. Utilizzando un microscopio, un'illuminazione e un set di filtri adeguati, è necessario valutare la specificità dell'ibridazione, l'intensità del segnale della sonda e il rapporto segnale/rumore di fondo al fine di determinare se l'ibridazione è stata ottimale per l'analisi. Dovrebbe essere facilmente enumerabile almeno l'85% dei nuclei complessivi dell'area target. Il "rumore" di fondo o la fluorescenza nucleare dovrebbero essere minimi. I segnali della sonda devono essere facilmente visibili utilizzando un minimo ingrandimento di 400X. La maggior parte dei nuclei sulla preparazione del vetrino deve essere separata dai nuclei circostanti e non deve essere coperta da citoplasma. La presenza di numerose aree di nuclei raggrumati (più di 3 nuclei per gruppo) può pregiudicare un'adeguata e omogenea distribuzione dei nuclei al fine di un'enumerazione accurata. Le preparazioni che non soddisfano questi criteri non dovrebbero essere utilizzate per l'enumerazione dei segnali. L'enumerazione dei segnali deve essere eseguita separatamente per ogni sonda in esame, tuttavia è accettabile enumerare le sonde CEP X e CEP Y contemporaneamente.

 

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Documentazione suggerita per il controllo qualità sulla preparazione dei vetrini e l'ibridazione in situ.

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