Nozioni di base su filtri e microscopi

Nozioni di base su filtri e microscopi

La linea dei set di filtri passa-banda a banda singola, doppia e tripla di Abbott Molecular è in continua espansione e consente una visualizzazione estremamente nitida e ad alto contrasto dei reagenti Abbott Molecular. Grazie alla visualizzazione di fino a un massimo di cinque differenti fluorofori in contemporanea, i set di filtri multibanda migliorano l'utilità della procedura di ibridazione fluorescente in situ (FISH), giacché è possibile ottenere più risultati simultaneamente da un unico saggio. Ciascun set di filtri è stato progettato e ottimizzato per essere utilizzato con i fluorofori Abbott Molecular. I set di filtri Abbott Molecular sono disponibili per la maggior parte dei comuni modelli di microscopi, inclusi:

  • Olympus®
  • Zeiss®
  • Leitz/Leica®
  • Nikon® 
Contatta il Servizio di assistenza tecnica per informazioni sui prezzi e sulla disponibilità di filtri per il vostro microscopio.
 
 
 
 
Nozioni di base di microscopia

Un microscopio a fluorescenza configurato correttamente e ben manutenuto è essenziale al fine di ottenere risultati ottimali nella FISH. È necessario seguire scrupolosamente le istruzioni fornite dal produttore riguardo il funzionamento e la manutenzione del proprio microscopio.

 
 
 
 
Sorgente luminosa di eccitazione

La lampada di eccitazione è la fonte luminosa che eccita i fluorofori portandoli a emettere il segnale di fluorescenza. Le due caratteristiche principali di una sorgente di eccitazione sono gli spettri di emissione e la loro intensità. Affinché si verifichi la fluorescenza, la lampada deve emettere radiazioni luminose che rientrino nei picchi di assorbimento di quei dati fluorofori. Quanto più forte è l'intensità di eccitazione, tanto più luminosa sarà la fluorescenza. Tuttavia, quanto più luminosa è l'intensità di eccitazione, tanto più rapida sarà la fotossidazione o la dissolvenza dei fluorofori. Qualsiasi scelta della lampada deve trovare un compromesso tra la luminosità dell'immagine osservata e la quantità di tempo durante la quale essa rimarrà visibile. Come sorgente luminosa di eccitazione, Vysis consiglia di utilizzare una lampada al mercurio da 100 Watt.

 
 
 
 
Obiettivi consigliati per l'ibridazione in situ
  • Obiettivi piani ottimizzati per la microscopia a fluorescenza; apertura numerica elevata (~1,3)
  • Obiettivi con il minor numero possibile di elementi Apertura numerica > o = 0,75
  • Non sono consigliato obiettivi con molti elementi Apertura numerica > o = 0,75

 

 
 
 
 
Set di filtri

I set di filtri sono progettati per la visualizzazione di un fluoroforo specifico o di una specifica combinazione di due o più fluorofori. Un set di filtri per la microscopia a fluorescenza è composto da tre elementi: un filtro di eccitazione per la selezione delle lunghezze d'onda utilizzate per eccitare il fluoroforo; uno specchio dicroico (con partitore di fascio o policroico) per riflettere la luce di eccitazione sul campione nel vetrino, che blocca gran parte della luce di eccitazione riflessa dal vetrino verso l'oculare e consente alla luce emessa dal fluoroforo durante l'ibridazione in situ di passare; e infine un filtro di emissione (filtro barriera) per far passare solamente la luce emessa dal fluoroforo, mentre tutte le altre lunghezze d'onda che non rientrano nell'intervallo specificato vengono bloccate.

 
 
 
 
Fluoroforo singolo

Set di filtri

I filtri si suddividono in tre classi principali: passa-banda (bandpass), passa-alto (long pass) e passa-basso (short pass). Un filtro passa-banda trasmette lunghezze d'onda entro uno specifico range, bloccando le lunghezze d'onda al di sotto e al di sopra dei valori di cut-off. Le lunghezze d'onda vengono bloccate al di sotto del cut-on o al di sopra del cut-off mediante assorbimento e/o riflessione. La banda passante o larghezza di banda (BW) è la larghezza del picco espressa in nanometri (nm) a metà di un dato picco di massima trasmissione. Può anche essere indicata come FWHM (larghezza a metà altezza) o HPBW (larghezza di banda a metà potenza). Un filtro passa-alto trasmette le lunghezze d'onda al di sopra di un determinato valore e blocca le lunghezze d'onda al di sotto di esso.

 

Un filtro passa-basso si comporta in modo opposto rispetto a quello passa-alto, quindi trasmette le lunghezze d'onda al di sotto di un determinato valore bloccando quelle al di sopra di tale valore. I filtri a interferenza sono realizzati tramite deposizione in vuoto di film sottili su un substrato di vetro. I film sottili sono costituiti da strati alternati metallici o dielettrici con indici di rifrazione alti e bassi. I filtri a interferenza possono essere progettati in modo da essere passa-basso, passa-alto o passa-banda. I filtri colorati in vetro sono realizzati con vetro impregnato di colorante e generalmente sono di tipo passa-alto o passa-banda. I filtri possono contenere più elementi di vetro colorato e/o di tipo interferenziale sovrapposti e incollati fra loro con collante epossidico per sistemi ottici (laminati). Se un filtro contiene elementi interferenziali viene denominato filtro a interferenza.

 

I filtri a interferenza sono assai apprezzati per la larghezza di banda stretta, l'elevata efficienza di trasmissione e soglie di cut-on e cut-off estremamente accurate. Questi filtri sono più costosi, meno duraturi e, in genere, hanno un rapporto segnale/rumore (S/N) più elevato rispetto ai filtri in vetro colorato. I filtri in vetro colorato di solito hanno una larghezza di banda ampia (ad esempio, 40 nm per eccitatore FITC), un'efficienza di trasmissione più bassa e cut-on e cut-off meno precisi. I filtri in vetro colorato vengono utilizzati perché facilmente reperibili, meno costosi e più duraturi. 

 

I filtri di eccitazione, di norma, sono filtri passa-banda. I filtri di eccitazione possono essere di vetro colorato o del tipo a interferenza. Quanto più ampia è la larghezza di banda, tanto maggiore sarà l'energia di eccitazione. Quando la larghezza di banda aumenta vi è un concomitante aumento dell'intensità di emissione, ma anche una più alta probabilità di generare autofluorescenza non specifica.

 

I filtri dicroici sono filtri a interferenza. I dicroici sono realizzati utilizzando una tecnologia a film sottile ma, proprio perché devono mantenersi sottili per offrire una qualità dell'immagine superiore, non sono protetti da un vetro di copertura laminato. I filtri dicroici privi di protezione sono particolarmente soggetti a graffi e altri danni. Nel caso dei filtri Zeiss Axioline, durante la fase di montaggio dei set l'utente deve fare attenzione a maneggiare il filtro dicroico afferrandolo solamente lungo i bordi e con indosso i guanti.

 

I filtri di emissione possono essere passa-banda o passa-alto.

 

I filtri di emissione possono essere del tipo a vetro colorato o interferenziale. I filtri passa-alto lasciano passare la maggior parte della luce, generando così immagini più luminose ma anche più rumorose, con più fondo e un rapporto segnale/rumore (S/N) inferiore. Questo aumento di rumore e di fondo è dovuto a detriti cellulari, al vetrino del microscopio, ecc.

 
 
 
 

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