Traslazione del Nick nella CGH: Preparazione dei reagenti

Traslazione del Nick nella CGH: Preparazione dei reagenti

 

0,2 mM SpectrumGreen o SpectrumRed dUTP

Aggiungere 10 µl di 1 mM dUTP a 40 µl di acqua libera da nucleasi.

 

0,1 mM dTTP

Aggiungere 10 µl di 0,3 mM dTTP a 20 µl di acqua libera da nucleasi.

 

Miscela 0,1 mM dNTP

Mescolare insieme 10 µl ciascuno di 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP e 0,3 mM dGTP.

 

DNA genomico estratto

Preparare una soluzione tra 0,2 µg/µl e 1 µg/ml di DNA genomico estratto in tampone Tris-EDTA (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,5).

 
 
 
 
Traslazione del Nick nella CGH: Procedura del saggio

 

Questa procedura marca circa 1 µg di DNA genomico estratto. Esso è sufficiente per cinque ibridazioni di CGH.

  1. Collocare una provetta per microcentrifuga su ghiaccio e lasciarla raffreddare.
  2. Aggiungere alla provetta questi componenti nell'ordine elencato:
    cgh-nick-translation-assay-procedure.gif
  3. Agitare brevemente su vortex la provetta.
  4. Incubare per 2 - 4 ore a 15 °C.
  5. Arrestare la reazione riscaldando a bagnomaria a 70 °C per 10 minuti.
  6. Raffreddare su ghiaccio. 

Determinare la dimensione della sonda

Determinare la dimensione della sonda è una parte essenziale della procedura CGH. Per istruzioni dettagliate sulla preparazione ed esecuzione di un gel di agarosio vedere (1) Maniatis T, Fritsch EF e Sambrook J. Gel electrophoresis of DNA. In: Molecular cloning: a laboratory manual. 2a ed. Cold Spring, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 o (2) Ausubel FM, ed. Preparation and Analysis of DNA. In: Current Protocols in Molecular Biology. New York: Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, 1989.

  1. Preparare un gel di agarosio all'1% aggiungendo 1 g di agarosio a 100 ml di tampone TAE. Riscaldare la soluzione nel forno a microonde fino a quando la soluzione di agarosio non si sia fusa. Questo volume è sufficiente per tre minigel.
  2. Raffreddare la soluzione di agarosio a 55 °C e aggiungere 10 µl di EtBr (la concentrazione finale è di 0,01% (v/v)).
  3. Versare l'agarosio fuso in un'apparecchiatura per minigel (10 cm x 6,5 cm) con pettini. Lasciare che l'agarosio si raffreddi fino a solidificare.
  4. Versare nell'apparecchiatura per minigel una quantità di tampone di corsa TAE sufficiente a ricoprire il gel per circa 1 mm.
  5. Rimuovere 9 µl di miscela di reazione contenente il DNA marcato con nick translation e aggiungere 1 µl di tampone di carico per gel.
  6. Caricare il campione marcato con nick translation in un pozzetto e un campione del marcatore delle dimensioni del DNA in un altro per misurare la dimensione della sonda.
  7. Sottoporre a elettroforesi il gel a 10 V/cm fino a quando il colorante nel tampone di caricamento del gel non sia di 2 - 3 cm dalla fine del gel.
  8. Stimare la gamma di dimensioni della sonda a partire dal gel. La maggior parte dello striscio di bande (smear) di DNA ottenuto dovrebbe essere tra 300 e 3000 bp. Frammenti della sonda che sono più grandi daranno una minore intensità di fluorescenza quando vengono utilizzati in un'analisi CGH. 

Se si aumenta la quantità di enzima e il tempo di incubazione, la distribuzione delle dimensioni si sposta verso frammenti di sonda progressivamente più piccoli. Per la produzione di frammenti di sonda più piccoli utilizzare queste condizioni che sono elencate in ordine di dimensione decrescente del frammento: 5 µl di miscela enzimatica/2 ore di incubazione, 5 µl di miscela enzimatica/4 ore di incubazione, 10 µl di miscela enzimatica/2 ore di incubazione e 10 µl di miscela enzimatica/4 ore di incubazione. Regolare la quantità di acqua libera da nucleasi aggiunta per mantenere il volume totale della reazione a 50 µl.

 
 
 
 

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