CGH - Ibridazione: Preparazione dei reagenti

CGH - Ibridazione: Preparazione dei reagenti

20X SSC, pH 5,3

Mescolare accuratamente 66 g di 20X SSC in 200 ml di H2O purificata. Regolare il pH a 5,3 a temperatura ambiente utilizzando HCl concentrato e QS fino a un volume finale di 250 ml. Conservare a temperatura ambiente. Gettare la soluzione in stock dopo 6 mesi o prima se la soluzione appare torbida o contaminata.

 

Soluzione di denaturazione

Aggiungere 49 ml di formammide, 7 ml di 20X SSC (pH 5,3) e 14 ml di H2O purificata in una vaschetta Coplin in vetro e mescolare accuratamente. Verificare che il pH sia 7,0 -7,5 misurando il pH a temperatura ambiente. Tra un utilizzo e l'altro, conservare coperta a 4ºC. Eliminare dopo 7 giorni.

 

Soluzioni di lavaggio con etanolo (70%, 85% e 100%)

Diluire l'etanolo al 100% v/v con H2O purificata per preparare le soluzioni di lavaggio. Tra un utilizzo e l'altro, conservare coperte a temperatura ambiente. Scartare le soluzioni in stock dopo 6 mesi.

 

0,4X SSC/Soluzione di lavaggio NP-40 al 0,3%

Mescolare accuratamente 20 ml di 20X SSC con 950 ml di H2O purificata. Aggiungere 3 ml di NP-40. Mescolare accuratamente fino a quando l'NP-40 non si sarà disciolto. Regolare il pH a 7,0 - 7,5 con NaOH. Aggiungere H2O purificata fino a portare il volume finale a 1 l. Conservare a temperatura ambiente. Eliminare la soluzione madre dopo 6 mesi, oppure non appena appare torbida o contaminata.

 

2X SSC/Soluzione di lavaggio NP-40 allo 0,1%

Aggiungere 1 ml di NP-40. Regolare il pH a 7,0 - 7,5 con NaOH. Aggiungere H2O purificata fino a portare il volume finale a 1 l. Conservare a temperatura ambiente. Eliminare la soluzione madre dopo 6 mesi, oppure non appena appare torbida o contaminata.

 

DNA test

Marcare direttamente il DNA test (e di controllo non marcato) con SpectrumGreenTM dUTP. Vedere il kit per la traslazione del nick Vysis CGH per la procedura.

 
 
 
 
CGH - Procedure

Controlli 

Controlli positivi e negativi forniscono confronti per valutare l'ibridazione e l'interpretazione dei dati CGH. Per un controllo negativo, usare DNA normale sia per il test che per il DNA di riferimento (Cat. n. 32-804024, 32-802024). I profili di intensità per questo esperimento dovrebbero rientrare entro i valori soglia come determinato dall'analisi delle immagini. Per un controllo positivo, utilizzare il DNA test (Cat. n. 32-800227) che è estratto da una linea cellulare con aberrazioni genetiche note che sono facili da rilevare mediante analisi CGH.

 

Vetrini target su metafase normale CGH

Non pretrattare i vetrini. I vetrini vengono preparati utilizzando metodi di preparazione citogenetica standard che sono ottimizzati per la CGH. I vetrini sono realizzati con linfociti stimolati da fitoemoagglutinina (PHA) coltivati per 48 - 72 ore prima dell'aggiunta di timidina per sincronizzare le cellule. La lunghezza del cromosoma è 400 - 550 bande. I linfociti sono derivati da donatore maschile con cariotipo normale.

 

Preparazione della miscela della sonda

Per produrre una ibridazione con intensità di segnale equivalente sia il DNA marcato con SpectrumGreenTM che per il DNA marcato con SpectrumRedTM, la quantità di DNA marcato con SpectrumGreen è aumentata.

  1. Combinare quanto segue in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml:
    10 µl (200 ng) di DNA test SpectrumGreen (marcato nick translation), 1 µl (100 ng) DNA genomico totale di riferimento SpectrumRed (Cat. n. 32-804023 o 32-804024), 10 µl (10 µg) DNA Human COT-1-1 (Cat. n. 32-800028)
  2. Aggiungere 1 µl (0,1 volume) di 3M acetato di sodio, poi aggiungere 52,5 µl (2,5 volumi) di EtOH al 100% per precipitare il DNA. Agitare brevemente su vortex e porre su ghiaccio secco per 15 minuti.
  3. Centrifugare a 12.000 giri/minuto per 30 minuti a 4 °C per formare pellet di DNA. 
  4. Rimuovere il surnatante e asciugare il pellet per dieci - quindici minuti sotto vuoto a temperatura ambiente.
  5. Risospendere il pellet in 3 µl di H2O purificata e 7 µl di tampone di ibridazione. Denaturare la sonda riscaldando la miscela della sonda per 5 minuti a bagnomaria a 73°C. NOTA: Denaturare la sonda mentre il vetrino viene disidratato (passaggio 3 dell'ibridazione della sonda sulla metafase target).

Ibridazione della sonda sulla metafase target 

  1. Contrassegnare le zone di ibridazione sul vetrino utilizzando un marcatore a punta di diamante.
  2. Assicurarsi che la temperatura della soluzione di denaturazione sia a 73±1°C. Immergere il vetrino contenente normali cromosomi in metafase nella soluzione per 5 minuti.
  3. Disidratare il vetrino per 1 minuto in una soluzione di etanolo al 70%, successivamente per 1 minuto in soluzione di etanolo all'85% e per 1 minuto in soluzione di etanolo al 100%.
  4. Asciugare il vetrino toccando il bordo inferiore con un foglio di carta assorbente e strofinando il lato inferiore con un tovagliolo di carta.
  5. Posizionare il vetrino su uno scalda vetrini a 45 - 50°C per consentire all'EtOH rimanente di evaporare.
  6. Applicare 10 µl della miscela della sonda denaturata sul vetrino. 
  7. Applicare immediatamente il vetrino coprioggetti e sigillare con mastice diluito.
  8. Porre il vetrino in un contenitore umido e sigillato e posizionarlo in un incubatore a 37°C per 48 - 72 ore per l'ibridazione.

Lavaggio del vetrino 

  1. Posizionare la vasca di lavaggio contenente la soluzione di lavaggio 0,4X SSC/0,3% NP-40 a bagnomaria a 74±1°C per almeno trenta minuti prima dell'uso. Eliminare dopo 1 giorno di utilizzo. Preparare una seconda vasca di lavaggio di 2X SSC/0,1% NP-40 a temperatura ambiente.
  2. Rimuovere il sigillo in mastice e il vetrino coprioggetti e porre immediatamente il vetrino nella soluzione di lavaggio 0,4X SSC/0,3% NP-40 a 74±1°C. Agitare il vetrino per 1 - 3 secondi.
  3. Ripetere il passo 2 per ogni vetrino - non lavare più di quattro vetrini alla volta - e poi lasciare riposare i vetrini per 2 minuti.
  4. Porre il vetrino nella soluzione di lavaggio 2X SSC/0,1% NP-40 a temperatura ambiente. Agitare il vetrino per 1 - 3 secondi e poi lasciare riposare da 5 secondi a 1 minuto.
  5.  Lasciare asciugare il vetrino all'aria e al buio.

Visualizzazione dell'ibridazione

Applicare 10 µl di colorante di contrasto DAPI II e un vetrino coprioggetto per ciascuna posizione di ibridazione.

 

 
 
 
 

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