CEP: Informazioni principali sul prodotto

CEP: Informazioni principali sul prodotto

 

1. Preparazione della sonda

  • A temperatura ambiente, mescolare 7 µl del tampone di ibridazione CEP, 1 µl della sonda DNA CEP e 2 µl di H2O purificata.*vysis-products-cep-protocol-1.gif
  • Centrifugare per 1 - 3 secondi, agitare su vortex e centrifugare nuovamente.
  • Scaldare per 5 minuti in bagnomaria a 73°C e poi posizionare su un riscaldatore per vetrini impostato a 45-50°C.

*Per l'ibridazione simultanea di due sonde CEP, sostituire 7 µl del tampone di ibridazione CEP, 1 µl di H2O purificata e 1 µl di ciascuna di due diverse sonde DNA CEP.

 

2. Preparazione dei vetrini

  • Contrassegnare le zone di ibridazione con un marcatore a punta di diamante.vysis-products-cep-protocol-2.gif
  • Immergere il vetrino in soluzione denaturante a 73+/-1°C (70% di formammide/2X SSC) per 5 minuti.
  • Disidratare il vetrino in soluzioni di EtOH al 70%, 85% e 100%, per 1 minuto in ciascuna.
  • Asciugare il vetrino e posizionarlo su un riscaldatore per vetrini (45-50°C) per un massimo di 2 minuti.

 

3. Ibridazione

  • Applicare 10 µl di miscela della sonda per vetrino. Coprire con il vetrino coprioggetti subito dopo vysis-products-cep-protocol-3.gifaver posizionato la sonda sulla vetrino. (Il vetrino non necessita di sigillatura durante le ibridazioni brevi).
  • Posizionare il vetrino in un contenitore non umido preriscaldato e procedere all'ibridazione incubando a 42°C per almeno 30 minuti (ma non oltre 60 minuti).
  • Preparare una vasca di lavaggio con 0,4X SSC/0,3%NP-40 e mettere a bagnomaria a 73+/-1°C per almeno 30 minuti. Eliminare dopo 1 giorno di utilizzo. Preparare una seconda vasca di 2X SSC/0,1% NP-40 a temperatura ambiente.
  • Rimuovere il vetrino coprioggetti e mettere immediatamente nella vasca lavaggio contenente 0,4X SSC/0,3%NP-40, agitando il vetrino per 1-3 secondi. Ripetere per gli altri tre vetrini, e poi lasciare tutti e quattro i vetrini nella vaschetta Coplin per 2 minuti.
  • Lavare il vetrino in una soluzione 2 X SSC/0,1% NP-40 a temperatura ambiente da 5 secondi a 1 minuto, agitando il vetrino per 1 - 3 secondi non appena viene immerso nella soluzione.
  • Far asciugare il vetrino all'aria al buio.

 

4. Interpretazione

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  • Applicare 10 µl di colorante di contrasto DAPI II all'area bersaglio del vetrino e collocare il coprioggetti.
  • Esaminare il vetrino utilizzando il corretto set di filtri.

 

 

5. Conservazionevysis-products-cep-protocol-5.gif

  • Conservare il vetrino a -20°C al buio. 
 
 
 
 
Informazioni procedurali per CEP

 

L'esposizione alIa luce fa sì che i fluorofori vadano rapidamente incontro a fotosbiancamento. Per limitare questa degradazione, manipolare tutte le soluzioni contenenti fluorofori in un ambiente a luminosità ridotta, compresi i passaggi che riguardano le operazioni sui vetrini ibridati. Effettuare tutte le operazioni di manipolazione che non richiedono la presenza di illuminazione (periodi di incubazione, lavaggi, ecc.) al buio. 

 

Per misurare la temperatura delle soluzioni è caldamente raccomandato l'uso di un termometro calibrato. 

 

Prima di aprire ogni singola fiala di reagente, si raccomanda di centrifugare per 2 - 3 secondi utilizzando una microcentrifuga da banco standard. 

 

Circa 30 minuti prima di utilizzarla, mettere la vaschetta Coplin, tenuta a temperatura ambiente e contenente la soluzione denaturante, a bagnomaria a 73+/-1°C. 

 

Se sono stati ibridati più di quattro vetrini, devono essere lavati in più di un batch. La temperatura della soluzione di lavaggio deve tornare a 73+/-1°C prima del lavaggio di ciascun batch.

 

 
 
 
 
Preparazioni CEP dei reagenti di lavoro

 

20X SSC (per 500 ml di 20X SSC, pH 5,3) 

Aggiungere 132 g di 20X SSC a 400 ml di H2O e mescolare accuratamente. Regolare il pH a temperatura ambiente a 5,3 con un apposito misuratore utilizzando HCl concentrato e regolare fino a un volume finale di 500 ml. Filtrare attraverso un'unità filtrante con pori da 0,45 micron. Conservare fino a sei mesi a temperatura ambiente.

 

2X SSC/0,1% NP-40 (per 1 litro)

Aggiungere 100 ml di 20X SSC (pH 5,3) a 850 ml di H2O purificata. Aggiungere 1,0 ml di NP-40. Regolare il pH a 7,0-7,5 con NaOH utilizzando un misuratore di pH. Aggiungere H2O fino a portare il volume finale della soluzione a 1 litro. Conservare fino a sei mesi a temperatura ambiente.  

 

Soluzione di lavaggio 0,4X SSC/0,37 NP-40 

Aggiungere H2O fino a portare il volume finale della soluzione a 1 litro. Filtrare attraverso un'unità filtrante con pori da 0,45 µm. Conservare fino a sei mesi a temperatura ambiente. Nota: La soluzione di lavaggio deve essere a 73+/-1°C prima dell'uso. Al fine di mantenere il corretto intervallo di temperatura, quattro vetrini alla volta DEVONO essere posti nella soluzione riscaldata. Se sono stati ibridati meno di quattro vetrini, devono essere utilizzati i vetrini per microscopio a temperatura ambiente per portare il numero dei vetrini a quattro. Se sono stati ibridati più di quattro vetrini, devono essere lavati in più di un batch. La temperatura della soluzione di lavaggio deve tornare a 73+/-1°C prima del lavaggio di ciascun batch. Non rimuovere i coprioggetti dai vari vetrini prima di aver collocato questi ultimi nella soluzione di lavaggio. Iniziare a cronometrare l'incubazione quando l'ultimo vetrino è stato immerso nella soluzione di lavaggio.

 

Soluzione denaturante (per 70 ml) 

Aggiungere 49 ml di formammide, 7 ml di 20X SSC (pH 5,3) e 14 ml di H2O purificata in una vaschetta Coplin in vetro e mescolare accuratamente. Misurare il pH a temperatura ambiente mediante un apposito misuratore per verificare che il pH sia compreso tra 7,0-8,0. Utilizzare ciascun batch di denaturante per sette giorni, quindi smaltire. Tra un periodo di utilizzo e l'altro conservare a 4°C.

 

Soluzioni di lavaggio con etanolo 

Per le concentrazioni finali al 70%, 85% e 100%. Preparare diluizioni v/v di etanolo al 100% con H2O. Utilizzare la diluizione fino a sette giorni, quindi smaltire. Se la soluzione evapora o diventa diluita, sostituire con soluzione fresca. Tra un periodo di utilizzo e l'altro, conservare a temperatura ambiente.

 
 
 
 

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