Elaborazione del campione di liquido amniotico

  1. Centrifugare 2-5 ml di un campione di liquido amniotico (LA) intero per 5 minuti a 1.000 giri/minuto. Il campione non deve apparire macchiato di sangue o marrone. 
  2. Risospendere il pellet in 2-5 ml di 1X tripsina/EDTA (tripsina allo 0,05%, 0,53 mM di EDTA 4Na in soluzione salina bilanciata di Hank senza CaCl2, MgCl2 6H2O e MgSO4 7H2O) e incubare a bagnomaria a 37 °C per almeno 15 minuti.
  3. Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 1.000 giri/minuto.
  4. Risospendere il pellet in 2-5 ml di KCI allo 0,56% e incubare per 20 minuti a bagnomaria a 37 ºC.
  5. Aggiungere 0,8-2 ml di fissativo (metanolo e acido acetico glaciale in proporzione 3:1) alle cellule/soluzione ipotonica e agitare delicatamente su vortex.
  6. Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 1.000 giri/minuto e risospendere il pellet in 1 ml di fissativo di fresco. Conservare i campioni fissati a 4 ºC per almeno trenta minuti o fino a quando non si è pronti per eseguire la FISH. Per la conservazione a lungo termine, conservare i campioni fissati a -20 ºC in fissativo.
  7. Prima di posizionare le cellule sui vetrini, regolare il volume della sospensione cellulare secondo la dimensione del pellet cellulare. Se necessario, in particolare dopo una conservazione prolungata (>1 mese), lavare i pellet con un fissativo prima di preparare i vetrini.
  8. Per preparare i vetrini per la FISH, versare la sospensione cellulare direttamente su 1 o 2 vetrini freddi, realizzando 2 zone di ibridazione (15-25 µl di sospensione cellulare per zona).

 Segue poi il kit di pretrattamento per FISH

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