Questions fréquemment posées

Applications

 

Puis-je réaliser le protocole FISH plusieurs fois sur la même zone d'hybridation ?

Oui. Consultez le protocole de coupe pour la méthode séquentielle FISH.

 

Quelle est la plus petite taille d'ADN (séquence d'ADN contiguë) qui peut être observée en utilisant les sondes Vysis marquées directement (CEP ou LSI) ?

La taille dépend de nombreux facteurs ; en général, environ 30 kilobases.

 

Comment mélanger les 2 sondes ?

Ajoutez 7 µl de tampon d'hybridation, 1 µl d'eau purifiée et 1 µl de CHAQUE sonde pour un volume total de 10 µl.

 
 
 
 
Filtres

 

Quels sont les filtres recommandés pour PathVysion, UroVysion et AneuVysion ?

  • PathVysion : (3 filtres) Vert/Orange v.2, DAPI/9-Orange et filtre passe-bande unique Vert. 
  • UroVysion : (4 filtres) DAPI, Rouge/Vert, Or et Aqua. 
  • AneuVysion : (4 filtres) DAPI/Orange/Vert, filtre passe-bande unique Vert, filtre passe-bande unique Orange et filtre passe-bande unique Aqua. 

Pour plus d'informations sur les filtres concernant les autres produits, contactez le Service Technique Vysis au 1-800-553-7042.

 

Quel type de source de lumière est optimal pour visualiser la fluorescence ?

Une lampe au mercure de 100 watts est recommandée et doit être changée toutes les 200 heures.

 

Pourquoi mes signaux fluorescents faiblissent-ils ?

Outre l'utilisation d'un filtre approprié, la source d'excitation du microscope et l'ancienneté de la lampe auront une incidence sur la force du signal fluorophore. Nous recommandons une lampe au mercure de 100 watts ayant moins de 200 heures d'utilisation. Certains signaux de sonde sont plus lumineux ou ont des formes différentes par rapport à d'autres signaux de sonde. Par exemple, un signal LSI® est plus compact qu'un signal CEP® et la personne qui visualise le signal peut interpréter cela comme un signal moins lumineux. En fait, le signal de la sonde LSI est juste plus petit. Les peintures chromosomiques WCP® ont des intensités de coloration différentes et la personne qui visualise le signal peut estimer que la couleur d'une peinture chromosomique WCP® n'est pas aussi vive que celle de la peinture chromosomique utilisée précédemment.

 

Un filtre rouge Texas peut-il être utilisé pour visualiser les sondes Vysis SpectrumOrange ?

Non. Les sondes SpectrumOrange nécessitent l'utilisation d'un filtre Vysis SpectrumOrange. Les longueurs d'onde Rouge et Orange sont assez proches dans le spectre des signaux à visualiser, mais l'intensité du signal ne sera pas reproductible.

 

Un filtre Or peut-il être utilisé pour visualiser les sondes Vysis SpectrumOrange ?

Non. Les sondes SpectrumOrange nécessitent l'utilisation d'un filtre Vysis SpectrumOrange. Les longueurs d'onde Or et Orange sont assez proches dans le spectre des signaux à visualiser, mais l'intensité du signal ne sera pas reproductible.

 
 
 
 
Généralités

 

Quelle est la différence entre un produit autorisé par la FDA et un produit approuvé par la FDA ?

L'approbation de la FDA se réfère aux produits qui sont approuvés pour la commercialisation dans le cadre du processus APMM (approbation préalable à la mise sur le marché) concernant les nouveaux dispositifs. L'autorisation de la FDA se réfère aux dispositifs dont la commercialisation a été autorisée dans le cadre d'un examen 510(K). En général, le processus d'approbation préalable à la mise sur le marché est plus strict, car il cible les produits véritablement novateurs. Les dispositifs qui sont conceptuellement similaires à ceux déjà sur le marché ou aux dispositifs qui représentent des améliorations par rapport aux produits existants peuvent choisir l'autorisation de la FDA dans le cadre d'un examen 510(K).

 

Peut-on obtenir des conseils de Vysis sur la façon de rapporter les résultats obtenus pour un patient ?

Non. Vysis n'est pas un laboratoire clinique et ne peut pas conseiller sur la façon de rapporter les résultats obtenus pour un patient. Vysis ne peut pas non plus donner de conseils en nomenclature.

 

Quelle est la différence entre un ASR et un DIV ?

ASR — Analyte Specific reagent (Réactif spécifique d'un analyte). Les ASR sont des produits destinés à des tests « maison ». Les fabricants de ces produits respectent strictement la déontologie médicale. Les ASR doivent être marqués conformément à la norme 21 CFR § 809.10(e). Le matériel publicitaire et promotionnel est réglementé par la norme 21 CFR § 809.30(D). Le laboratoire qui développe un test « maison » utilisant les ASR doit informer le donneur d'ordre du résultat du test en annexant au rapport d'essai cette déclaration conformément à la norme 21 CFR § 809.30(e) : « Ce test a été développé par (nom du laboratoire) et les caractéristiques de performance de ce test ont été déterminées par (nom du laboratoire). Il n'a pas été autorisé ou approuvé par la FDA des États-Unis. » L'utilisation prévue des ASR n'est pas définie ; le laboratoire est responsable de la détermination de l'utilisation prévue et des seuils. Exemples de produit Vysis ASR : LSI® bcr/abl, LSI DiGeorge, TotelVysionIVD. Diagnostic in vitro (DIV) — Produit de diagnostic autorisé ou approuvé par la FDA pour une ou plusieurs utilisations spécifiques avec des caractéristiques analytiques et cliniques établies. Exemples de produit Vysis DIV : PathVysion, UroVysion, AneuVysion, CEP® 8 SO, CEP 12 SO, CEP X/Y.

 

Pourquoi les numéros de lot sur les flacons sont-ils différents des numéros de lot du kit ?

Le numéro de lot qui figure sur le certificat d'analyse fourni avec chaque sonde est le numéro de lot du kit. La plupart des kits sont constitués d'un flacon de sonde et d'un flacon de tampon d'hybridation. D'autres kits contiennent des sondes pré-mélangées avec un tampon d'hybridation. Chacun des composants comporte un numéro de composant et un numéro de lot distincts de ceux du kit. Lors de la commande du produit à partir de notre catalogue, le numéro à utiliser est le numéro de catalogue, et non les numéros de composants individuels qui apparaissent sur les flacons contenus dans le kit.

 
 
 
 
Sondes

 

Quelle est la stabilité des sondes ? Puis-je congeler/décongeler les sondes ? Puis-je les stocker diluées ? 

Lorsque les sondes sont stockées correctement, elles sont stables. Elles peuvent être congelées et décongelées plusieurs fois. Il y a moins de risque que les sondes se dégradent si elles sont stockées non diluées.

 

Ai-je besoin d'amplifier le signal ?

Non, l'amplification du signal n'est pas nécessaire. Les sondes Vysis à marquage direct possèdent des signaux de couleur vive ne nécessitant pas d'étapes de détection supplémentaires.

 

Puis-je réduire la quantité de sondes par analyse ?

Non, la force du signal serait trop faible.

 

Quelle est la différence entre les sondes marquées directement et les sondes marquées indirectement ?

Avec des sondes marquées directement, le fluorophore est lié de façon covalente à la sonde ADN. Avec des sondes marquées indirectement, un haptène, tel que la biotine ou la digoxigénine, est intégré dans la sonde. Une série d'étapes de posthybridation (« sandwiching ») permet à un fluorophore d'être lié à l'haptène.

 

Quand dois-je utiliser des sondes WCP plutôt que des sondes CEP ?

Les sondes CEP sont utilisées à la fois sur les cellules interphasiques et les étalements métaphasiques et peuvent être utilisées pour déterminer la ploïdie (par exemple, la trisomie 18). Les sondes de peinture d'un chromosome entier (sondes WCP) sont utilisées uniquement sur les étalements en métaphase. La communauté scientifique déconseille l'utilisation sur des cellules interphasiques, en raison des difficultés d'interprétation des résultats.

 

Les sondes WCP subissent-elles une réaction croisée avec d'autres chromosomes humains ou avec des chromosomes de rongeurs ?

Une certaine réaction croisée avec d'autres chromosomes humains peut se produire avec les sondes WCP. Le mélange de sondes contient de l'ADN Cot-1®* humain pour réduire la liaison à des séquences répétées sur l'ADN cible et l'ADN non cible. Il est possible d'ajouter plus d'ADN Cot-1. Certaines des sondes WCP sont préparées à partir de banques d'ADN de chromosomes humains triés obtenus à partir d'hybrides de cellules somatiques d'humain ou de hamster. Utilisez l'ADN Cot-1 GIBCO/BRL de hamster ou l'ADN Cot-1 de souris comme réactif de blocage pour analyser le contenu en chromosomes humains d'hybrides de cellules somatiques.

 

En cas de mélange de sondes LSI avec des sondes CEP, quel tampon d'hybridation utiliser ?

Utilisez le tampon d'hybridation LSI. Le tampon CEP est plus exigeant que le tampon LSI. La sonde LSI a besoin du tampon moins exigeant pour s'hybrider à sa cible. Vysis n'a pas testé toutes les configurations de combinaison de sondes LSI et CEP possibles. Il est possible qu'avec certains mélanges de sondes, la sonde CEP subisse une hybridation croisée avec d'autres chromosomes en raison de conditions d'exigence plus faibles.

 

Comment mélanger les 2 sondes ?

Ajoutez 7 µl de tampon d'hybridation, 1 µl d'eau purifiée et 1 µl de CHAQUE sonde pour un volume total de 10 µl.

 

Pourquoi mes signaux fluorescents faiblissent-ils ?

Outre l'utilisation d'un filtre approprié, la source d'excitation du microscope et l'ancienneté de la lampe auront une incidence sur la force du signal fluorophore. Nous recommandons une lampe au mercure de 100 watts ayant moins de 200 heures d'utilisation. Certains signaux de sonde sont plus lumineux ou ont des formes différentes par rapport à d'autres signaux de sonde. Par exemple, un signal LSI est plus compact qu'un signal CEP et la personne qui visualise le signal peut interpréter cela comme un signal moins lumineux. En fait, le signal de la sonde LSI est juste plus petit. Les peintures chromosomiques WCP ont des intensités de coloration différentes et la personne qui visualise le signal peut estimer que la couleur d'une peinture chromosomique WCP n'est pas aussi vive que celle de la peinture chromosomique utilisée précédemment. Comparé à certains signaux amplifiés de sondes marquées indirectement, le signal provenant de sondes marquées directement peut être décrit comme faible par certaines personnes qui visualisent le signal. Les signaux de sondes Vysis peuvent sembler plus petits, mais la couleur des signaux est d'intensité égale. De plus, en raison de l'absence de fluorescence de fond, le vrai signal est plus facile à voir et à distinguer des autres signaux.

 
 
 
 
Préparation des échantillons

 

Quels aspects doivent avoir mes lames (avec des préparations en métaphase) avant de passer au protocole FISH ?

Évaluez vos préparations de lames avec un microscope à contraste de phase.

  • Bonne préparation : Les chromosomes et les noyaux doivent être gris terne, non réfractiles, et avec un minimum de cytoplasme.
  • Mauvaise préparation : Les cellules sont « en phase lumineuse » : elles apparaissent blanches avec un halo autour des noyaux. Cause possible : L'échantillon sur les lames a peut-être séché trop rapidement au cours de la préparation. Solution :
    • Augmentez l'humidité autour de la lame lors du « dépôt » de l'échantillon en le plaçant sur un portoir, puis chauffez le portoir au bain-marie à 65 °C pendant 20 minutes.
    • Ne surchauffez pas les lames ; cela pourrait nuire aux résultats de l'hybridation.
    • Séchez les lames à la température ambiante pendant une nuit. De meilleurs résultats sont obtenus lorsque les lames « murissent » pendant la nuit à température ambiante.
  • Les lames préparées et utilisées le même jour sont bien moins optimales, mais les étapes suivantes peuvent être réalisées pour préparer les lames en une journée : commencez par sécher la lame sur un chauffe-lames à 45 °C pendant 30 minutes, puis déshydratez la lame pendant une minute dans des solutions d'éthanol à 70 %, 85 % puis 100 % avant de dénaturer l'ADN cible (étape 1 du protocole FISH).

 

Après avoir suivi le protocole FISH, j'obtiens un signal faible et une « brume » recouvre la lame. Comment puis-je corriger cela ?

Généralement, cela est dû à une densité trop élevée de cellules déposées sur la lame. La brume est due au cytoplasme cellulaire. Essayez de laver le culot de cellules avec du fixateur frais, diluez l'échantillon et déposez l'échantillon sur une nouvelle lame. Certains types d'échantillons (appositions de tissus, frottis de moelle osseuse ou de sang, échantillons inclus en paraffine) peuvent être davantage sujets au problème de formation de « brume ». Ces types d'échantillons peuvent avoir besoin de traitements additionnels :

  • Frottis : Lavez 30 secondes dans de l'acide acétique à 70 %, séchez à l'air, puis lavez une deuxième fois 30 secondes dans du méthanol à 100 %.
  • Inclus en paraffine : augmente le temps de digestion des protéines.

 

Pourquoi le contre-colorant est-il trop pâle ?

Les lames n'ont peut-être pas été séchées correctement avant l'application du contre-colorant. Assurez-vous que les lames « murissent » pendant 24 heures après le dépôt des cellules. Essayez de déshydrater les échantillons en procédant à une série de lavages dans de l'éthanol, puis appliquez de nouveau le contre-colorant. Assurez-vous également d'utiliser le filtre approprié pour visualiser le contre-colorant. Deux concentrations de contre-colorant DAPI sont disponibles chez Vysis. Le DAPI II (125 ng/ml) est utilisé avec les sondes CEP® et LSI®. Il s'agit d'une dilution au huitième du colorant DAPI I (1000 ng/ml) qui est utilisée avec les peintures chromosomiques WCP®. L'utilisation de DAPI II avec des sondes WCP peut produire une contre-coloration trop faible.

 

Pourquoi la morphologie cellulaire de mon échantillon est-elle déformée ?

Différents types de tissus ou d'échantillons peuvent nécessiter différents temps de dénaturation. Si le temps de dénaturation est trop long pour le type d'échantillon, les cellules apparaîtront déformées. Essayez un temps de dénaturation de quatre minutes pour commencer, puis ajustez en conséquence.

 

Combien de temps puis-je stocker mes lames préparées et les hybrider ensuite efficacement ?

Si les lames sont conservées à -20 °C sous azote, elles devraient être utilisables pendant au moins six mois.

 

Après l'hybridation, combien de temps puis-je stocker mes lames et voir encore la fluorescence ?

Si les lames sont stockées à -20 °C et ne sont pas exposées trop fréquemment à la lumière UV haute intensité de la lampe au mercure, elles dureront plusieurs mois. Les signaux vont s'estomper avec le temps et avec l'exposition à la lumière.

 

Puis-je exécuter le protocole FISH après avoir réalisé un marquage en bande G sur mes étalements de métaphase ?

Oui, la référence suivante contient une procédure pour cela :

 

JalalSM, Law ME, Christensen ER, Spurbeck JL, Dewald GW. Method for sequential staining of GTLbanded metaphases with fluorescent labeled chromosome specific paint probes. Am J Med Genet 46:98103, 1993.

 
 
 
 
Réactifs

 

Pourquoi les procédures Vysis ne requièrent pas l'ajout de produits empêchant les couleurs de pâlir lors de l'analyse FISH ?

Les contre-colorants Vysis, le contre-colorant DAPI I, le contre-colorant DAPI II et le contre-colorant à base de iodure de propidium, contiennent déjà des produits empêchant les couleurs de pâlir.

 

La solution de lavage contenant 0,1 % de NP-40 devient trouble quand je la chauffe. Quel est le problème ?

C'est normal. L'aspect trouble est normal et n'interfère pas avec le lavage.

 

Quelle est la différence entre DAPI I et DAPI II ?

Le contre-colorant DAPI I a une concentration de 1 000 ng/ml, il est donc 8 fois plus concentré que le contre-colorant DAPI II, dont la concentration est de 125 ng/ml. Le DAPI I plus concentré fonctionne bien avec les peintures chromosomiques WCP® et confère une contre-coloration visuelle vive pour les chromosomes en métaphase. Le DAPI II moins concentré est conçu pour être utilisé avec les sondes CEP® et LSI® dont les signaux plus compacts peuvent être submergés par une trop forte contre-coloration DAPI de l'ADN nucléaire.

 

Quelle différence existe-t-il entre les kits de prétraitement à la paraffine I, II et III ?

Le kit I de prétraitement à la paraffine doit être utilisé avec les échantillons de tissus PathVysion® Her-2 neu. Ce kit a été approuvé par la FDA avec l'utilisation de ces échantillons. C'est un prétraitement plus long (environ une heure de plus) qu'avec le kit II. Le kit II de prétraitement à la paraffine est un protocole de prétraitement plus court destiné à être utilisé sur des coupes en paraffine autres que pour les échantillons de tissus PathVysion Her-2 et les échantillons de tissu prostatique. Le kit III de prétraitement à la paraffine est un protocole plus strict conçu pour être utilisé sur des échantillons de tissu de la prostate ou sur des échantillons particulièrement difficiles. Ce kit contient l'enzyme protéinase K au lieu de la pepsine.

 

De quoi sont composés les tampons d'hybridation ?

  • Tampon d'hybridation CEP : Formamide 55 %, 1X SSC, sulfate de dextran 10 %
  • Tampon d'hybridation LSI/WCP : Formamide 50%, 2X SSC, sulfate de dextran 10 %
 
 
 
 

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