ToTelVysionTM : Mélanges de sondes ADN FISH multicolores

ToTelVysionTM : Mélanges de sondes ADN FISH multicolores

Prétraitement des échantillons avant co-dénaturation.

 

La procédure de prétraitement suivante est vivement recommandée avant l'hybridation des sondes ToTelVysion sur des préparations de lames en métaphase. Le but de cette procédure est de rendre l'ADN chromosomique accessible à l'hybridation et de protéger la morphologie des chromosomes du processus de co-dénaturation.

  1. Incubez les lames d'échantillons dans un tube de Coplin contenant une solution 2X SSC à 73 °C pendant 2 minutes. 
  2. Incubez les lames dans un tube de Coplin contenant une solution de protéase/pepsine pendant 10 minutes à 37 °C. 
  3. Lavez les lames dans un tube de Coplin contenant la solution PBS à température ambiante pendant 5 minutes. 
  4. Placez les lames dans un tube de Coplin contenant une solution de formaldéhyde pendant 5 minutes à température ambiante. 
  5. Retirez les lames de la solution de formaldéhyde et lavez-les dans un tube de Coplin contenant du PBS pendant 5 minutes à température ambiante. 
  6. Déshydratez les lames en les plongeant 1 minute dans de l'éthanol à 70 %, puis 1 minute dans de l'éthanol à 85 %, puis 1 minute dans de l'éthanol à 100 %. 
  7. Laissez sécher les lames à l'air.

 

Le mélange de sondes ADN ToTelVysion FISH multicolores comporte au total 62 sondes ADN FISH.

 

 
Composant Sonde ADN ToTelVysion multicolore
Quantité 30 µl x 15 flacons contenant divers mélanges de sondes
Composition Sondes CEP® et LSI® TelVysion marquées au fluorophore et blocage d'ADN mélangé au tampon d'hybridation contenant du sulfate de dextran, du formamide et du SSC (pH 7,0)
Stockage -20 °C à l'abri de la lumière 
 
 
FLACON TOTELVYSION n DESCRIPTION DU MÉLANGE DE SONDES
Mélange 1 TelVysion 1p SpectrumGreen, TelVysion 1q SpectrumOrange, TelVysion Xp/Yp SpectrumOrange et SpectrumGreen, CEP X SpectrumAqua
Mélange 2 TelVysion 2p SpectrumGreen, TelVysion 2q SpectrumOrange, TelVysion Xp/Yp SpectrumOrange et SpectrumGreen, CEP X SpectrumAqua
Mélange 3

TelVysion 3p SpectrumGreen, TelVysion 3q SpectrumOrange, TelVysion 22q SpectrumOrange et SpectrumGreen, LSI bcr (22q11) SpectrumAqua

Mélange 4 TelVysion 4p SpectrumGreen, TelVysion 4q SpectrumOrange, TelVysion 21q SpectrumOrange et SpectrumGreen, LSI AML (21q22) SpectrumAqua
Mélange 5 TelVysion 5p SpectrumGreen, TelVysion 5q SpectrumOrange 
Mélange 6 TelVysion 6p SpectrumGreen, TelVysion 6q SpectrumOrange, TelVysion 13q SpectrumOrange et SpectrumGreen, LSI 13 (13q14) SpectrumAqua
Mélange 7 TelVysion 7p SpectrumGreen, TelVysion 7q SpectrumOrange, TelVysion 14q SpectrumOrange et SpectrumGreen, LSI TCR (14q11.2) SpectrumAqua
Mélange 8 TelVysion 8p SpectrumGreen, TelVysion 8q SpectrumOrange, TelVysion 17p SpectrumOrange et SpectrumGreen, CEP 17 SpectrumAqua
Mélange 9 TelVysion 9p SpectrumGreen, TelVysion 9q SpectrumOrange, TelVysion 17q SpectrumOrange et SpectrumGreen, CEP 17 SpectrumAqua
Mélange 10 TelVysion 10p SpectrumGreen, TelVysion 10q SpectrumOrange, TelVysion 15q SpectrumOrange et SpectrumGreen, LSI PML (15q22) SpectrumAqua
Mélange 11 TelVysion 11p SpectrumGreen, TelVysion 11q SpectrumOrange, TelVysion 18p SpectrumOrange et SpectrumGreen, CEP 18 SpectrumAqua
Mélange 12 TelVysion 12p SpectrumGreen, TelVysion 12q SpectrumOrange, TelVysion 18q SpectrumOrange et SpectrumGreen, CEP 18 SpectrumAqua
Mélange 13 TelVysion 16p SpectrumGreen, TelVysion 16q SpectrumOrange
Mélange 14 TelVysion 19p SpectrumGreen, TelVysion 19q SpectrumOrange, LSI 19p13 SpectrumAqua
Mélange 15 TelVysion 20p SpectrumGreen, TelVysion 20q SpectrumOrange 

 

 

Matériel requis mais non fourni

  • HCl 12N (pour ajuster le pH des solutions de lavage) 
  • NaOH 1N (pour ajuster le pH des solutions de lavage) 
  • Tubes de Coplin
  • Thermomètre étalonné 
  • Pinces 
  • Cylindre gradué (de 100 à 1 000 ml)
  • Agitateur magnétique 
  • Éthanol à 100 % 
  • Microcentrifugeuse 
  • Embouts de pipettes pour volumes de 1 à 10 µl 
  • Pipette pour volumes de 1 à 10 µl 
  • pH-mètre 
  • Lames de microscope en verre pré-nettoyées 
  • Eau purifiée (distillée ou déionisée) 
  • Minuterie 
  • Mélangeur vortex 
  • Bains-marie (37 et 73 °C)
  • Microscope à fluorescence 
  • Incubateur à 37 °C 
  • Citrate de sodium standard 20X (SSC), 500 g (référence 02J10-032) de NP-40, 4 000 µl (référence 07J05-001, quantité 2)
  • Formamide, qualité ultra pure 
  • Contre-colorant DAPI II 
  • Chauffe-lames (45 à 50 °C) 
  • Huile à immersion pour microscope à fluorescence 
  • Colle caoutchouc 
  • Lamelles (rondes, 12 mm)
  • Stylo à pointe diamant
  • Seringue jetable
  • Bandelettes de contrôle du pH
  • Unité de filtration de 0,45 µm
  • Chambre humide
  • Tampon phosphate salin (PBS) 
  • Formol neutre tamponné à 10 % 
  • Chlorure de magnésium 2M (MgCl2) 
  • Protéase/pepsine

 

Préparation de la cible d'échantillon

Afin d'hybrider les 15 mélanges ToTelVysion, utilisez un minimum de 3 lames d'échantillons marquées, avec 5 lames cibles par lame pour un total de 15 zones cibles.

 

totelvysion-multi-color-dna-fish-probe-mixtures-slide.gif

Exemple de lame n° 1 contenant des cibles 1, 2, 3, 4 et 5. Répétez le même type d'organisation des cibles pour les lames 2 et 3, avec 5 cibles sur chaque lame.

 

 
 
 
 
Préparation de la sonde

Préparation de la sonde et ajout du mélange de sondes sur la lame d'échantillon

  1. Chaque mélange de sondes ToTelVysion est pré-mélangé et préparé dans un tampon d'hybridation. Retirez les flacons de l'environnement à -20 °C (±5 °C). Décongelez-les à température ambiante. 
  2. Centrifugez chacun des flacons décongelés de mélange de sondes pendant 1 à 3 secondes dans une microcentrifugeuse. 
  3. Passez-les sur un mélangeur vortex, puis centrifugez-les brièvement à nouveau. 
  4. Prélevez 3 µl de sonde du flacon à l'aide d'une micropipette et placez-la dans un tube à microcentrifugation. Préparez la sonde de chacun des 15 flacons de la même manière. 
  5. Placez chacun des tubes à microcentrifugation contenant les 3 µl de sonde dans un bain-marie à 73 °C ±1 °C pendant 5 minutes pour dénaturer la sonde. 
  6. Retirez les tubes du bain-marie. 
  7. Placez les tubes sur un chauffe-lames réglé à 45-50 °C jusqu'à ce que vous soyez prêt à appliquer la sonde sur l'ADN cible.

Remarque : si les lames sont prêtes lorsque la sonde est dénaturée, vous pouvez appliquer la sonde immédiatement sur l'ADN cible. 

 

Hybridation de la sonde sur la cible d'échantillon

Remarque : préparez une chambre humide en plaçant une serviette en papier humectée d'eau sur le côté d'un conteneur hermétique. 

  1. Retirez les lames de l'éthanol à 100 %. 
  2. Séchez les lames en mettant en contact le bord inférieur avec un buvard et en essuyant la face inférieure avec une serviette en papier. 
  3. Placez les lames sur un chauffe-lames réglé à 45-50 °C pendant 2 minutes maximum pour permettre l'évaporation de l'éthanol restant. 
  4. Appliquez 3 µl de mélange de sondes sur 1 zone cible et appliquez immédiatement une lamelle ronde de 12 mm. Répétez cette opération pour 14 autres zones cibles.

Remarque : ne laissez pas les lamelles de chaque zone cible entrer en contact. Si les lamelles sont en contact, l'action capillaire entraînera le déplacement de la sonde d'une cible vers l'autre.

 

5. Scellez chaque lamelle avec de la colle caoutchouc, en veillant à ce que la colle caoutchouc se superpose au bord de la lamelle pour créer un joint étanche entre la lamelle et la surface des lames. 

 

6. Placez les lames dans la chambre humide préchauffée et placez la chambre dans un incubateur à 37 °C pendant 12 à 24 heures. 

 

Lavage des lames

Préparez les solutions de lavage :

Remarque : amenez les solutions à la température appropriée avant de commencer la procédure de lavage.

  • Versez 70 ml de solution de lavage 0,4X SSC/0,3 % de NP-40 dans un tube de Coplin. Placez le tube dans un bain-marie à 73 °C ±1 °C au moins 30 minutes avant utilisation. Utilisez la solution pendant 1 jour, puis jetez-la.
  • Versez 70 ml de solution de lavage 2X SSC/0,1 % de NP-40 dans un tube de Coplin. Utilisez la solution à température ambiante. Utilisez la solution pendant 1 jour, puis jetez-la.

Remarque : pour maintenir la bonne température de la solution 0,4X SSC/0,3 % de NP-40, lavez 4 lames en même temps. Si vous avez moins de 4 lames, ajoutez des lames vierges se trouvant à température ambiante, pour porter le total à 4.

 

 7.  Retirez les lamelles des lames et immergez-les immédiatement dans la solution 0,4X SSC/0,3 % de NP-40 à 73 °C ±1 °C. Agitez les lames pendant 1 à 3 secondes. Répétez l'opération avec les autres lames.  

 

8.   Retirez les lames au bout de 2 minutes.

 

9.  Immergez les lames dans une solution 2X SSC/0,1 % de NP-40 à température ambiante. Agitez les lames pendant 1 à 3 secondes. Retirez les lames au bout de 30 secondes à 2 minutes. 

 

Visualisation de l'hybridation

  1. Laissez sécher les lames à l'air dans l'obscurité.
  2. Appliquez 3 µl de contre-colorant DAPI II sur chaque zone cible des lames et appliquez une lamelle ronde de 12 mm. Sinon, appliquez 10 µl de contre-colorant DAPI II sur chaque moitié des lames et appliquez une lamelle de 22 x 50 mm au-dessus du contre-colorant. Appuyez une légère pression sur le haut de la lamelle pour éliminer l'excès de contre-colorant DAPI. Séchez avec une serviette en papier. 

Réglage des paramètres ThermoBrite

Placez immédiatement chacune des lames (avec la sonde et la lamelle) sur la surface du système ThermoBrite. Humidifiez les bandelettes humides avec de l'eau et placez-les dans le couvercle.

  1. Scellez chaque lamelle avec de la colle caoutchouc, en veillant à ce que la colle caoutchouc se superpose au bord de la lamelle pour créer un joint étanche entre la lamelle et la surface des lames.
  2. Pour les lymphocytes et les amniocytes mis en culture, réglez la température de dénaturation sur 70 °C et la durée de dénaturation sur 3 minutes. (Remarque : ces températures peuvent nécessiter un ajustement en fonction du type d'échantillon. Reportez-vous au manuel d'utilisation du système ThermoBrite [55-005322].)
  3. Réglez la température d'hybridation sur 37 °C et la durée d'hybridation sur 12 à 16 heures (pour la nuit).
  4. Lorsque la durée d'hybridation est écoulée, lavez les lames conformément à la procédure de lavage rapide comme indiqué précédemment.
  5. Laissez sécher la lame à l'air dans l'obscurité.
  6. Appliquez 3 µl de contre-colorant DAPI II sur chaque zone cible de la lame et appliquez une lamelle ronde de 12 mm.
 
 
 
 

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