Lames colorées avant le protocole FISH : Préparation des solutions

Préparation des solutions
  • Préparez une solution mère de pepsine. Conservez-la au congélateur. Dissolvez 0,5 g de pepsine dans 5 ml d'eau distillée. La concentration de pepsine est de 100 mg/ml.
  • Préparez une solution de travail de pepsine (0,05 mg/ml). Ajoutez 20 µl de solution mère de pepsine dans 40 ml de HCl 10 mM. La concentration finale de pepsine est de 0,05 mg/ml.
  • Solution de fixation au formaldéhyde 1 % (V =400 ml). Mélangez 10 ml de formaldéhyde à 37 % avec 386 ml de PBSx1 et 4 ml de 100XMgCl2 100XMgCl2 = 2 M MgCl2. Conservez la solution au réfrigérateur. Jetez-la après chaque utilisation. Jetez la solution après chaque utilisation.
 
 
 
 
Retrait des lamelles
  1. Plongez les lames dans du xylène pendant environ 48 h à température ambiante ou jusqu'à ce que les lamelles soient faciles à retirer ou qu'elles glissent des lames.
  2. Lavez les lames dans du xylène frais pendant 5 min. Il est conseillé de laver les lames une troisième fois en les plongeant dans une nouvelle solution de xylène pendant 5 min.
  3. Laissez sécher les lames à l'air pendant environ 15 min.
  4. Placez les lames dans un tube de Coplin contenant de l'éthanol à 95 %. Le stockage au réfrigérateur est possible pendant plusieurs jours/semaines.
  5. Lavez les lames dans un tube de Coplin contenant de l'éthanol à 85 % pendant 5 minutes, puis lavez-les dans un tube de Coplin contenant de l'éthanol à 70 % pendant 5 min.
  6. Incubez les lames dans une solution 2X SSC pendant 15 à 60 min
  7. Procédez à un pré-traitement suivi d'un protocole FISH.
 
 
 
 
Procédure de prétraitement
  1. Incubez les lames dans la solution 2X SSC pendant 10 min à 37 °C.
  2. Incubez les lames dans la solution de travail de pepsine pendant 13 min à 37 °C.
  3. Incubez dans la solution PBS X1 pendant 5 min à température ambiante.
  4. Fixez les lames dans la solution de formaldéhyde 1 % pendant 5 min à température ambiante.
  5. Nettoyez les lames dans la solution PBS X1 pendant 5 min à température ambiante.
  6. Procédez à la dénaturation des lames en suivant le protocole FISH.
 
 
 
 

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