Prétraitement des échantillons inclus en paraffine

Les lames d'échantillons de coupes de paraffine ont été préparées à l'avance et ont été chauffées à 56 °C. Vous effectuerez le reste du protocole de prétraitement, puis des hybridations avec les sondes Her-2/neu / CEP® 17.

 

Retrait de la paraffine des lames

La solution Hemo-De est un solvant non toxique dont les propriétés sont semblables à celles du xylène. Elle permet de dissoudre la paraffine. L'éthanol déshydrate l'échantillon et solubilise le reste de la paraffine, afin de le préparer pour le prétraitement.

____ 1. Immergez les lames dans une solution Hemo-De pendant 10 minutes à température ambiante.

____ 2. Répétez cette opération deux fois, avec une nouvelle solution Hemo-De à chaque fois.

____ 3. Déshydratez les lames dans une solution d'éthanol absolu (EtOH) à 100 % pendant 5 minutes à température ambiante.

____ 4. Répétez l'étape 3.

____ 5. Laissez sécher les lames à l'air ou placez-les sur un chauffe-lames à 45-50 °C pendant 2 à 5 minutes.

 

Prétraitement des lames

Le chlorure d'hydrogène (HCl) contribue à solubiliser les protéines nucléaires de base, améliorant ainsi l'accessibilité de l'ADN pour les sondes. L'HCl permet également d'extraire les protéines de la matrice extracellulaire qui limitent l'accessibilité de la sonde aux cellules et entraînent une autofluorescence des tissus. Le tampon de prétraitement contribue à la dénaturation des protéines et à la suppression des réticulations entre les protéines. Ceci est important pour permettre une digestion suffisante de la protéase.

____ 1. Immergez les lames dans une solution HCl 0,2 N pendant 20 minutes.

____ 2. Immergez les lames dans de l'eau purifiée pendant 3 minutes.

____ 3. Immergez les lames dans du tampon de lavage pendant 3 minutes.

____ 4. Immergez les lames dans une solution de prétraitement à 80 °C pendant 30 minutes.

____ 5. Immergez les lames dans de l'eau purifiée pendant 1 minute.

____ 6. Immergez les lames dans du tampon de lavage pendant 5 minutes. Répétez l'opération en utilisant le deuxième tube de tampon de lavage. 

 

Traitement des lames avec de la protéase

La protéase sert à digérer les protéines tissulaires. Elle est essentielle pour l'accessibilité des sondes à l'ADN cible.

____ 1. Retirez les lames du deuxième tube de tampon de lavage et éliminez l'excès de tampon en tamponnant les bords des lames sur une serviette en papier.

____ 2. Immergez les lames dans une solution de protéase à 37 °C pendant 10 minutes.

____ 3. Immergez les lames dans du tampon de lavage pendant 5 minutes. Répétez l'opération en utilisant le deuxième tube de tampon de lavage.

____ 4. Séchez les lames sur un chauffe-lames à 45-50 °C pendant 2 à 5 minutes.

 

Fixation de l'échantillon

La fixation de l'échantillon assure une perte minimale des tissus pendant la dénaturation et l'hybridation.

____ 1. Immergez les lames dans du formol tamponné à 10 % à température ambiante pendant 10 minutes.

____ 2. Immergez les lames dans du tampon de lavage pendant 5 minutes. Répétez l'opération en utilisant le deuxième tube de tampon de lavage.

____ 3. Séchez les lames sur un chauffe-lames à 45-50 °C pendant 2 à 5 minutes. Suivez le protocole relatif à la sonde Vysis LSI®.

 

Dénaturation de l'échantillon

____ 1. Placez les lames dans la solution de dénaturation préchauffée à 72 °C ±1 °C (<6/tube) pendant 6 minutes.

____ 2. Déshydratez-les dans de l'éthanol absolu (EtOH) à 70 %, 85 % et 100 %, 1 minute à chaque fois.

____ 3. Séchez les lames sur un chauffe-lames à 45-50 °C pendant 2 à 5 minutes.

 

Hybridation

____ 1. Préchauffez la sonde à température ambiante, passez le tube au mélangeur vortex et centrifugez-le.

____ 2. Ajoutez 10 ml du mélange de sondes sur la zone d'échantillon de la lame.

____ 3. Placez 22 lamelles de 22 mm et scellez les bords avec de la colle au caoutchouc.

____ 4. Placez les lames dans la chambre humide préchauffée avec un couvercle bien fermé dans un incubateur à 37 °C pour la nuit (14 à 18 heures).

 

Lavage post-hybridation

____ 1. Ajoutez le tampon de lavage post-hybridation dans chacun des deux tubes de Coplin. Préchauffez un tube dans le bain-marie à 72 °C ±1 °C et laissez le deuxième à température ambiante.

____ 2. Retirez le joint en colle au caoutchouc des lames en tirant doucement dessus avec des pinces.

____ 3. Immergez les lames dans le tampon de lavage post-hybridation à température ambiante et faites flotter à nouveau la lamelle.

____ 4. Éliminez l'excès de liquide en détachant le bord des lames et immergez les lames dans un tampon de lavage post-hybridation à 72 °C ±1 °C pendant 2 minutes (6 lames/tube).

____ 5. Retirez les lames du tampon de lavage et laissez-les sécher à l'air dans l'obscurité en position verticale.

 

Contre-coloration et stockage des lames

____ 1. Appliquez 10 ml de contre-colorant DAPI sur la zone cible des lames et appliquez une lamelle en verre. Stockez les lames dans l'obscurité avant le dénombrement des signaux. Ou stockez-les à l'étape suivante.

____ 2. Stockez les lames hybridées (avec les lamelles) à -20 °C dans l'obscurité. Après le stockage à -20 °C, laissez les lames revenir à température ambiante avant de les visualiser au microscope à fluorescence.

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