Préparation de globules polaires humains

Cette procédure est effectuée après l'élimination opérée par les globules polaires. Les globules polaires sont biopsiés à partir d'ovocytes fécondés et non fécondés par dissection mécanique.

Procédure

  1. Préparez un fixateur (3:1, méthanol:acide acétique glacial) et conservez-le au congélateur jusqu'à ce qu'il soit prêt à être utilisé.
  2. Préparez le tube de Coplin contenant du méthanol.
  3. Gravez un petit cercle dans le fond d'une boîte de Petri 35 x 10 mm. Le cercle identifie la zone cible dans laquelle placer le globule polaire de façon à le déplacer facilement.
  4. Notez l'identification de l'échantillon, ainsi que toute information pertinente sur la zone dépolie de la lame du microscope. Pré-nettoyez la lame en l'essuyant avec un fixateur et un chiffon non pelucheux.
  5. Remplissez une lame à goutte suspendue avec de l'eau purifiée.
  6. Chauffez la pointe d'une pipette capillaire de 25 µl à l'aide d'une micro-torche et tirez simultanément sur la pointe de la pipette chauffée pour étendre et créer une pointe d'un diamètre intérieur de 50 µm. Assurez-vous que la pointe de la pipette étendue est régulière de façon à éviter qu'elle soit tranchante. Une pointe tranchante peut endommager le globule polaire. Cassez à nouveau la pointe, si nécessaire, afin de créer une pointe lisse. La taille de l'ouverture de la pipette doit être vérifiée avant le prélèvement des globules polaires. Cela permet de s'assurer qu'il s'agit de la bonne taille ; si le diamètre est trop grand, le risque de perdre le globule polaire augmente.
  7. Aspirez une petite quantité (environ 2 à 3 µl) d'eau dans la pipette.
  8. À l'aide d'un stéréomicroscope, localisez le globule polaire dans la boîte de Petri.
  9. Aspirez doucement le globule polaire dans la pipette et transférez-le sur la lame à goutte suspendue contenant l'eau. Libérez le globule polaire de la pipette en soufflant doucement, en le plaçant à l'intérieur du cercle central de la lame à goutte suspendue.
  10. Déplacez le globule polaire de l'eau en l'aspirant avec une petite quantité d'eau dans la pipette atténuée. Transférez la cellule sur une lame de microscope avec une petite quantité d'eau. Gravez un cercle sur le dessus de la lame, autour de la goutte d'eau, avec un marqueur à pointe de carbure.
  11. Laissez le globule polaire sécher dans la goutte d'eau sur la lame en examinant constamment la partie sous le microscope retourné. Une fois le globule sec, aspirez une petite quantité de fixateur (environ 2 à 3 µl) dans la même pipette atténuée et déposez le fixateur sur le globule polaire.

    Remarque : lorsque vous fixez les premiers globules polaires 6 heures après l'extraction, laissez s'égoutter le fixateur juste avant le séchage complet afin d'éliminer tout le cytoplasme.
  12. Placez une autre goutte de fixateur de la pipette atténuée sur la cellule avant le séchage complet à moins que le cytoplasme ne se soit clairement et effectivement dissous. Répétez l'opération jusqu'à ce que le cytoplasme entourant la cellule se soit dissous en laissant uniquement le noyau (appliquez le fixateur au moins 5 fois).

    Remarque : l'élimination complète du cytoplasme est essentielle pour une hybridation optimale de la sonde.
  13. En utilisant le stylo, dessinez deux cercles autour de la chromatine sur la face supérieure de la lame de verre. Vous devez faire en sorte qu'un cercle soit un peu plus grand que l'autre. En d'autres termes, un cercle doit se trouver à l'intérieur de l'autre et la cellule, au milieu du petit cercle. Le cercle entourant la cellule facilitera la localisation de cette dernière après la procédure d'hybridation.
  14. Placez la lame dans le tube de Coplin contenant du méthanol pendant 5 minutes.
  15. Retirez la lame du méthanol et laissez-la sécher à l’air.
  16. À l'aide d'une échelle de vernier, sur la platine du microscope, ou d'un système England Finder, localisez et notez l'emplacement de la cellule sur la lame du microscope. Ces coordonnées vous aideront à localiser la cellule après l'hybridation.
  17. Réalisez un autre petit cercle sur le fond de la lame du microscope, autour de la cellule, à l'aide d'un marqueur permanent afin de définir la zone sur laquelle appliquer la sonde.

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