Prétraitement à la paraffine 3

Le protocole de version courte ne doit pas remplacer la notice d'emballage.

Utilisation prévue
Pour préparer des coupes de tissus inclus en paraffine et fixés sur des lames chargées positivement pour une utilisation en hybridation fluorescente in situ (FISH*) avec des sondes ADN Vysis FISH multicolores. 

Résumé et principe
La procédure qui suit a été conçue pour optimiser la processabilité et la perméabilité des tissus pour la méthode FISH lors de l'utilisation de sondes ADN Vysis FISH multicolores (p. ex., Sonde ProVysionTM muticolore, référence de commande 32-131090). Cette analyse de prétraitement aidera à réduire au maximum le fond de particules lourdes après hybridation de la sonde ADN, phénomène qui peut parfois se produire dans des types de tissus spécifiques.

Préparation des lames avec échantillon
Remarque : utilisez des échantillons qui ont été fixés au formol pendant 24 à 48 heures.

1. Réalisez des coupes de paraffine de 4 à 5 &mgr;m d'épaisseur à l'aide d'un microtome.
2.  Faites flotter les coupes dans un bain-marie purifié (c'est-à-dire, triplement distillé) à 40 °C.
3. Déposez la coupe sur une lame chargée positivement.
4. Séchez les lames à l'air et chauffez pendant une nuit à 56 °C.

Retrait de la paraffine des lames

1. Immergez les lames dans une solution Hemo-De pendant 5 minutes à température ambiante.
2. Répétez l'étape 1 deux fois, avec une nouvelle solution Hemo-De à chaque fois.
3. Déshydratez les lames dans une solution d'éthanol absolu (EtOH) à 100 % pendant 1 minute à température ambiante. Répétez l'opération.
4. Laissez sécher les lames à l'air pendant 2 à 5 minutes, si nécessaire.

Prétraitement de la lame/protéase

1. Immergez les lames dans de l'acide formique à 45 %/0,3 % de peroxyde d'hydrogène pendant 15 minutes.
2. Immergez les lames dans de l'eau purifiée pendant 3 minutes. Enlevez l'excès d'eau en tamponnant les bords des lames sur une serviette en papier.
3. Immergez les lames dans une solution de prétraitement à 80°C pendant 10 minutes.
4. Rincez à l'eau fraîche purifiée pendant 3 minutes.
5. Incubez dans une solution de travail de protéase à 37 °C pendant 10 minutes. Mesurez 50 ml (EXACTEMENT) de tampon de protéase III et placez-le dans un bain-marie à 37 °C ±1 °C. Assurez-vous que la température du tampon est de 37 °C ±1 °C avant de l'utiliser. Préparez la solution mère de protéase en ajoutant 9,0 mg (un tube) de protéase à 515 &mgr;l d'eau purifiée.
   
   Pour préparer la solution de travail de protéase
   Pipetez 100 &mgr;l de solution mère de protéase dans la bouteille de 50 ml de tampon de protease III (volume chaud et soigneusement mesuré). Congelez le reste de la solution mère de la protéase.
6. Arrêtez la réaction par incubation dans une solution de protéase d'arrêt pendant 3 minutes.
7. Rincez les lames dans de l'eau purifiée pendant 3 minutes.
8. Laissez sécher les lames à l'air pendant 2 à 5 minutes.
9. Suivez le protocole approprié pour la sonde Vysis.