Prétraitement à la paraffine 2

Le protocole de version courte ne doit pas remplacer la notice d'emballage.

Utilisation

Pour préparer des coupes de tissus inclus en paraffine fixées sur des lames chargées positivement pour une utilisation en hybridation in situ en fluorescence (FISH) avec des sondes ADN Vysis FISH multicolores.

Résumé et principe

La procédure qui suit a été conçue pour maximiser la perméabilité des tissus pour la technique FISH lors de l'utilisation de sondes ADN Vysis FISH multicolores.

Réactifs fournis dans le kit Référence 32-801210    Pour utilisation en laboratoire

Réactif Quantité Composition Stockage
Solution de prétraitement 5 x 50 ml Thiocyanate de sodium (NaSCN) 2 à 25 °C
Tampon de protéase II 5 x 62,5 ml HCl 0,2 N, pH 1,0 2 à 25 °C
Protéase 5 x 250 mg 2 500 - 3 000 U/mg protéase, lyophilisée -20 à 8 °C

Matériel requis mais non fourni

  • Éthanol absolu (EtOH)
  • Produit nettoyant Hemo-De (Scientific Safety Solvents, référence HD-150)
  • Eau purifiée (distillée ou déionisée)
  • Tubes de Coplin (capacité de 16 lames / 8 fentes)
  • Bains-marie à 37 °C et 80 °C (un à 73 °C pour l'analyse de sonde)

 

Préparation des lames avec échantillon

Remarque : utilisez des échantillons qui ont été fixés au formol pendant 24 à 48 heures.

  1. Réalisez des coupes de paraffine de 4 à 5 &mgr;m d'épaisseur à l'aide d'un microtome.
  2. Faites flotter les coupes dans un bain-marie purifié (c'est-à-dire, triplement distillé) à 40 °C.
  3. Déposez une coupe sur une lame chargée positivement.
  4. Laissez sécher les lames à l'air.
  5. Chauffez les lames à 56 °C pendant une nuit.

 

Retrait de la paraffine des lames

  1. Immergez les lames dans une solution Hemo-De pendant 5 minutes à température ambiante.
  2. Répétez l'étape 1 deux fois, avec une nouvelle solution Hemo-De à chaque fois.
  3. Déshydratez les lames dans une solution d'éthanol absolu (EtOH) à 100 % pendant 1 minute à température ambiante. Répétez l'opération.
  4. Laissez sécher les lames à l'air pendant 2 à 5 minutes, si nécessaire.

 

Prétraitement des lames

  1. Immergez les lames dans une solution de prétraitement à 80 °C pendant 10 minutes. Si nécessaire, deux lames peuvent être placées dos à dos dans chaque fente du tube de Coplin, une lame placée à chaque extrémité. Pour les lames placées aux extrémités, le côté de la lame où se trouve la coupe tissulaire doit faire face au centre du tube.
  2. Immergez les lames dans de l'eau purifiée pendant 3 minutes.

 

Prétraitement de la protéase

  1. Retirez les lames du tube d'eau purifiée.
  2. Enlevez l'excès d'eau en tamponnant les bords des lames sur une serviette en papier.
  3. Immergez les lames dans une solution de protéase à 37 °C pendant 15 minutes. (Assurez-vous que la température du tampon est de 37 °C ±1 °C avant d'ajouter 250 mg [un tube] de protéase.) Si nécessaire, deux lames peuvent être placées dos à dos dans chaque fente du tube de Coplin, une lame placée à chaque extrémité. Pour les lames placées aux extrémités, le côté de la lame où se trouve la coupe tissulaire doit faire face au centre du tube.
  4. Immergez les lames dans de l'eau purifiée pendant 3 minutes.
  5.  Laissez sécher les lames à l'air pendant 2 à 5 minutes.

 

Fixation de l'échantillon

Remarque : la fixation d'un échantillon vise à minimiser la perte de tissus lors de sa dénaturation. Cette procédure est vivement recommandée lors du traitement d'échantillons dans un bain dénaturant.

  1. Remplissez un (1) tube de Coplin de 50 ml de formol tamponné à 10 %. Remplissez trois (3) autres tubes de Coplin de 50 ml d'éthanol à 70 %, 85 % et 100 % chacun.
  2. Immergez les lames dans du formol tamponné à 10 % à température ambiante pendant 10 minutes.
  3. Immergez les lames dans de l'eau purifiée pendant 3 minutes.
  4. Laissez sécher les lames à l'air.
  5. Suivez le protocole approprié pour la sonde Vysis.

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