Prétraitement à la paraffine

Le protocole de version courte ne doit pas remplacer la notice d'emballage.

Utilisation

Pour préparer des coupes de tissus inclus en paraffine fixées sur des lames chargées positivement pour une utilisation en hybridation in situ en fluorescence (FISH) avec des sondes Vysis.

Réactifs fournis

Réactif Quantité Composition Stockage
Solution de prétraitement 5 x 50 ml Thiocyanate de sodium (NaSCN) 2 à 25 °C
Tampon de protéase 5 x 50 ml NaCl, pH 2,0 2 à 25 °C
Tampon de lavage 5 x 250 mg 2X SSC, pH 7,0 2 à 25 °C
Protéase 5 x 25 mg 2 500 - 3 000 U/mg protéase, lyophilisée -20 °C

Préparation des lames d'échantillons (en option)

Remarque : utilisez des échantillons qui ont été fixés dans du formol pendant 24 à 48 heures.

  1. Réalisez des coupes de paraffine de 4 à 5 &mgr;m d'épaisseur à l'aide d'un microtome.
  2. Faites flotter les coupes dans un bain-marie purifié (c'est-à-dire, triplement distillé) à 40 °C.
  3. Déposez une coupe sur une lame chargée positivement.
  4. Laissez sécher les lames à l'air.
  5. Chauffez les lames à 56 °C pendant une nuit.

Retrait de la paraffine des lames

  1. Immergez les lames dans une solution Hemo-De pendant 10 minutes à température ambiante.
  2. Répétez l'étape 1 deux fois, avec une nouvelle solution Hemo-De à chaque fois.
  3. Déshydratez les lames dans une solution d'éthanol absolu (EtOH) à 100 % pendant 5 minutes à température ambiante. Répétez l'opération.
  4. Laissez sécher les lames à l'air ou placez-les sur un chauffe-lames à 45-50 °C pendant 2 à 5 minutes.

Prétraitement des lames

  1. Immergez les lames dans une solution HCl 0,2 N pendant 20 minutes.
  2. Immergez les lames dans de l'eau purifiée pendant 3 minutes.
  3. Immergez les lames dans du tampon de lavage pendant 3 minutes.
  4. Immergez les lames dans une solution de prétraitement à 80 °C pendant 30 minutes. Deux lames peuvent être placées dos à dos dans chaque fente du tube de Coplin, une lame placée à chaque extrémité. Pour les lames placées aux extrémités, le côté de la lame où se trouve la coupe tissulaire doit faire face au centre du tube. 
  5. Immergez les lames dans de l'eau purifiée pendant 1 minute.
  6. Immergez les lames dans du tampon de lavage pendant 5 minutes. Répétez l'opération en utilisant le deuxième tube de tampon de lavage.

Traitement des lames avec de la protéase

  1. Retirez les lames du deuxième tube de tampon de lavage.
  2. Enlevez l'excès de tampon en tamponnant les bords des lames sur une serviette en papier.
  3. Immergez les lames dans une solution de protéase à 37 °C pendant 10 minutes. (Assurez-vous que la température du tampon est de 37 °C ±1 °C avant d'ajouter 25 mg [un tube] de protéase.)
  4. Immergez les lames dans du tampon de lavage pendant 5 minutes. Répétez l'opération en utilisant le deuxième tube de tampon de lavage.
  5. Séchez les lames sur un chauffe-lames à 45-50 °C pendant 2 à 5 minutes.

Fixation de l'échantillon

  1. Immergez les lames dans du formol tamponné à 10 % à température ambiante pendant 10 minutes.
  2. Immergez les lames dans du tampon de lavage pendant 5 minutes. Répétez l'opération en utilisant le deuxième tube de tampon de lavage.
  3. Séchez les lames sur un chauffe-lames à 45-50 °C pendant 2 à 5 minutes.
  4. Suivez le protocole approprié pour la sonde Vysis.

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