Kit cassures-déplacement : Préparation des réactifs

Kit cassures-déplacement : Préparation des réactifs

 

SpectrumGreen 0,2 mM, SpectrumOrangeTM ou 

Ajoutez 10 µl de dUTP 1 mM à 40 µl d'eau exempte de nucléase.

 

dTTP 0,1 mM

Ajoutez 10 µl de dTTP 0,3 mM à 20 µl d'eau exempte de nucléase.

 

Mélange dNTP 0,1 mM

Mélangez 10 µl de dATP 0,3 mM, 10 µl de dCTP 0,3 mM et 10 µl de dGTP 0,3 mM.

 

Extrait d'ADN de P1, de BAC (chromosome bactérien artificiel) ou de YAC (chromosomes artificiels de levure)

Préparez une solution d'extrait d'ADN de 0,2 µg/µl à 1 µg/µl dans un tampon Tris-EDTA (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,5). 

 
 
 
 
Kit cassures-déplacement : Procédure d'analyse

Cette procédure marque environ 1 µg d'extrait d'ADN de P1, de BAC ou de YAC. Cela permet de réaliser dix expériences FISH (une zone cible étant égale à 22 mm x 22 mm). 

  1. Placez un tube à microcentrifugation sur la glace et laissez-le refroidir.
  2. Ajoutez ces composants dans le tube dans l'ordre indiqué. Centrifugez le tube brièvement et passez brièvement le tube sur un agitateur vortex avant d'ajouter l'enzyme (dernier composant) :
    nick-translation-assay-procedure-chart.gif
  3. Centrifugez et agitez brièvement le tube au vortex.
  4. Incubez pendant 8 à 16 heures à 15 °C.
  5. Arrêtez la réaction en chauffant le tube au bain-marie à 70 °C pendant 10 minutes.
  6. Refroidissez le tube sur de la glace.

Détermination de la taille de la sonde

La détermination de la taille de la sonde est une partie essentielle de la procédure de marquage. Pour obtenir des instructions détaillées sur la préparation et la migration d'un gel d'agarose consultez (1) Maniatis T, Fritsch EF et Sambrook J. Gel electrophoresis of DNA. Dans : Molecular cloning : a laboratory manual (Clonage moléculaire : un manuel de laboratoire). 2 ème édition Cold Spring, NY : Cold Spring Harbor Laboratory; 1989 ou (2) Ausubel FM, ed. Preparation and Analysis of DNA. Dans : Current Protocols in Molecular Biology (Protocoles actuels en biologie moléculaire). New York : Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, 1989.

 

REMARQUE : en raison de la structure isomérique des fluorophores, le dUTP non incorporé apparaît sur le gel d'agarose sous la forme de deux domaines présentant un éclat différent. La structure chimique et la charge nette des différents fluorophores influent sur le schéma de migration sur le gel. Par exemple, un dUTP SpectrumGreenTM non incorporé migre vers le dessus du gel, tandis qu'un dUTP SpectrumOrangeTM et un dUTP SpectrumRedTM migrent vers le fond du gel et risquent de recouvrir le frottis de la sonde ADN. Dans ce cas, retirez le dUTP non incorporé par précipitation à l'éthanol et/ou par filtration sur gel de la sonde ADN marquée avant de charger un échantillon de la sonde ADN sur le gel d'agarose pour le calibrage.

 

En augmentant la quantité d'enzymes et le temps d'incubation, la répartition en fonction de la taille se fait entre les fragments de sonde de plus en plus petits. Pour produire des fragments de sonde plus petits, appliquez les conditions suivantes, énumérées par ordre décroissant de taille du fragment :

 

5 µl d'un mélange d'enzymes/8 heures d'incubation, 5 µl d'un mélange d'enzymes/16 heures d'incubation, 10 µl d'un mélange d'enzymes/8 heures d'incubation et 10 µl d'un mélange d'enzymes/16 heures d'incubation. Ajustez la quantité d'eau exempte de nucléase ajoutée pour conserver le volume total de réaction à 50 µl.

 
 
 
 
Exécution du protocole FISH avec la sonde marquée

Ce protocole est recommandé pour l'hybridation de sondes à séquence unique sur les cellules lymphocytaires. Il peut être nécessaire de modifier la procédure selon le type et la taille de la sonde.

 

Précipitation de la sonde

  1. Pipetez 5 µL (environ 100 ng de sonde) du mélange réactif cassures-déplacement dans un tube à microcentrifugation.
  2. Ajoutez 1 µg d'ADN COT-1, 2 µg d'ADN de placenta humain et 4 µl d'eau purifiée dans le tube.
  3. Ajoutez 1,2 µl (0,1 volume) d'acétate de sodium 3 M, puis 30 µl (2,5 volumes) d'éthanol 100 % pour précipiter l'ADN. Passez brièvement le tube sur un agitateur vortex puis placez-le sur de la glace sèche pendant 15 minutes.
  4. Centrifugez à 12 000 tr/min pendant 30 minutes à 4 °C pour culotter l'ADN.
  5. Retirez le surnageant et séchez sous vide le culot pendant 10 à 15 minutes à température ambiante.
  6. Remettez le culot en suspension dans 3 µl d'eau purifiée et 7 µl de tampon d'hybridation.
  7. Dénaturez la sonde en chauffant le mélange de sondes au bain-marie pendant 5 minutes à 73 °C.

 

Hybridation de la sonde sur la métaphase cible

  1. Marquez les zones d'hybridation sur la lame à l'aide d'un stylo à pointe diamant.
  2. Assurez-vous que la température de la solution de dénaturation (Formamide 70 % dans 2X SSC, pH 7,0 - 8,0) est à 75 °C. Immergez la lame dans la solution contenant des étalements de métaphase normale pendant 5 minutes.
  3. Déshydratez la lame en la plongeant 1 minute dans de l'éthanol à 70 %, puis 1 minute dans de l'éthanol à 85 %, et enfin 1 minute dans de l'éthanol à 100 %.
  4. Séchez la lame en plaçant son bord inférieur sur un buvard et en essuyant sa face inférieure avec une serviette en papier.
  5. Placez la lame sur un chauffe-lames à 45-50 °C pour permettre l'évaporation de l'éthanol restant.
  6. Appliquez 10 µl du mélange de sondes dénaturées sur la lame.
  7. Déposez immédiatement la lamelle et scellez avec de la colle au caoutchouc.
  8. Placez la lame dans une chambre scellée et humide, puis la boîte dans un incubateur à 37 °C pendant 16 heures pour permettre l'hybridation.

 

Lavage des lames

  1. Avant toute utilisation, chauffez au bain-marie le récipient contenant la solution de lavage 0,4X SSC/0,3 % de NP-40 à 73 °C ±1 °C pendant au moins 30 minutes. Jetez après 1 jour d'utilisation. Préparez un second récipient contenant une solution 2X SSC/0,1 % de NP-40 à température ambiante.
  2. Retirez le joint en colle au caoutchouc et la lamelle et chauffez immédiatement au bain-marie la lame dans la solution de lavage 0,4X SSC/0,3 % de NP-40 à 73 °C ±1 °C. Agitez la sonde pendant 1 à 3 secondes.
  3. Répétez l'étape 2 pour chaque lame (ne lavez pas plus de quatre lames à la fois), puis laissez les lames sur leur support pendant 2 minutes.
  4. Placez la lame dans la solution de lavage 2X SSC/0,1 % de NP-40 à température ambiante. Agitez la lame pendant 1 à 3 secondes puis laissez-la sur son support pendant 5 secondes à 1 minute.
  5. Laissez sécher la lame à l'air dans l'obscurité.

Visualisation de l'hybridation

Appliquez 10 µl de contre-colorant DAPI II et une lamelle sur chaque zone d'hybridation.

 
 
 
 

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