Préparation lymphocytaire : Préparation du milieu de culture

Préparation lymphocytaire : Préparation du milieu de culture
  1. Prélevez 8 à 10 ml de sang périphérique dans un tube Vacutainer de 10 ml à bouchon vert contenant un conservateur à l'héparine sodique. Mélangez soigneusement.
  2. Transférez dans des conditions d'asepsie le contenu du tube Vacutainer dans un tube à centrifuger de 15 ml.
  3. Centrifugez l'échantillon à 2 000 tr/min pendant 10 minutes dans une centrifugeuse de paillasse.
  4. Retirez avec précaution la couche de plasma à l'aide d'une pipette Pasteur. Jetez la couche de plasma conformément aux procédures de votre laboratoire relatives à l'élimination des matières biologiques.
  5. Retirez la couche leuco-plaquettaire en tournant doucement autour tout en prélevant les leucocytes dans une pipette Pasteur. Il est possible qu'une petite quantité d'érythrocytes et de plasma soit également prélevée ; réduisez au maximum la quantité d'érythrocytes prélevée.
  6. Placez la couche leuco-plaquettaire dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 1,5 ml de milieu cRPMI.
  7. Aliquotez le volume approprié de suspension leucocytaire dans des flacons de 25 cm2 contenant 10 ml de milieu cRPMI. 
  8. Ajoutez 0,2 ml de phytohémagglutinine (PHA) dans chaque flacon ; couvrez en serrant bien, puis desserrez légèrement pour permettre au CO2 d'entrer dans le flacon.
  9. Incubez le milieu de culture :

pour la préparation des lames FISH...

Cette méthode produit des chromosomes avec une résolution de 400 à 450 bandes, ce qui est suffisant pour la plupart des applications. 

    • Incubez le milieu de culture à 37° C ±1 °C, dans un environnement à 5 % de CO2 pendant 72 à 96 heures.

pour la préparation des lames CGH...

Ces étapes supplémentaires augmentent l'élongation des chromosomes et l'indice mitotique. Pour l'analyse CGH, les chromosomes doivent avoir une résolution de 400 à 550 bandes.

    • Incubez le milieu de culture à 37° C ±1 °C, dans un environnement à 5 % de CO2 pendant 48 à 72 heures.
    • Ajoutez 0,2 ml de solution de thymidine dans chaque flacon et mélangez doucement.
    • Incubez le milieu de culture pendant 14 à 18 heures.
    • Transférez le milieu de culture dans un tube à centrifuger de 15 ml.
    • Centrifugez à 1 000 tr/min pendant 10 minutes.
    • Décantez le surnageant et ajoutez 10 ml de tampon phosphate salin (PBS).
    • Centrifugez à 1 000 tr/min pendant 10 minutes.
    • Décantez le surnageant et ajoutez 10 ml de cRPMI dans chaque tube.
    • Incubez le milieu de culture pendant 4 à 5 heures.
 
 
 
 
Prélèvement du milieu de culture
  1. Prélevez 8 à 10 ml de sang périphérique dans un tube Vacutainer de 10 ml à bouchon vert contenant un conservateur à l'héparine sodique. Mélangez soigneusement.
  2. Transférez dans des conditions d'asepsie le contenu du tube Vacutainer dans un tube à centrifuger de 15 ml.
  3. Centrifugez l'échantillon à 2 000 tr/min pendant 10 minutes dans une centrifugeuse de paillasse.
  4. Retirez avec précaution la couche de plasma à l'aide d'une pipette Pasteur. Jetez la couche de plasma conformément aux procédures de votre laboratoire relatives à l'élimination des matières biologiques.
  5. Retirez la couche leuco-plaquettaire en tournant doucement autour tout en prélevant les leucocytes dans une pipette Pasteur. Il est possible qu'une petite quantité d'érythrocytes et de plasma soit également prélevée ; réduisez au maximum la quantité d'érythrocytes prélevée.
  6. Placez la couche leuco-plaquettaire dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 1,5 ml de milieu cRPMI.
  7. Aliquotez le volume approprié de suspension leucocytaire dans des flacons de 25 cm2 contenant 10 ml de milieu cRPMI.
  8. Ajoutez 0,2 ml de phytohémagglutinine (PHA) dans chaque flacon ; couvrez en serrant bien, puis desserrez légèrement pour permettre au CO2 d'entrer dans le flacon.
  9. Incubez le milieu de culture :

pour la préparation des lames FISH...

Cette méthode produit des chromosomes avec une résolution de 400 à 450 bandes, ce qui est suffisant pour la plupart des applications. 

    • Incubez le milieu de culture à 37° C ±1 °C, dans un environnement à 5 % de CO2 pendant 72 à 96 heures.

pour la préparation des lames CGH... 

Ces étapes supplémentaires augmentent l'élongation des chromosomes et l'indice mitotique. Pour l'analyse CGH, les chromosomes doivent avoir une résolution de 400 à 550 bandes.

    • Incubez le milieu de culture à 37° C ±1 °C, dans un environnement à 5 % de CO2 pendant 48 à 72 heures.
    • Ajoutez 0,2 ml de solution de thymidine dans chaque flacon et mélangez doucement.
    • Incubez le milieu de culture pendant 14 à 18 heures.
    • Transférez le milieu de culture dans un tube à centrifuger de 15 ml.
    • Centrifugez à 1 000 tr/min pendant 10 minutes.
    • Décantez le surnageant et ajoutez 10 ml de tampon phosphate salin (PBS).
    • Centrifugez à 1 000 tr/min pendant 10 minutes.
    • Décantez le surnageant et ajoutez 10 ml de cRPMI dans chaque tube.
    • Incubez le milieu de culture pendant 4 à 5 heures. 
 
 
 
 
Fixation de l'échantillon
  1. Ajoutez lentement 2 ml de fixateur de Carnoy et laissez-le s'écouler dans chaque tube à centrifuger.
  2. Tapotez doucement sur le tube à centrifuger pour mélanger la suspension du culot de cellules au fixateur.
  3. Ajoutez lentement 6 ml supplémentaires de fixateur de Carnoy dans chaque tube.
  4. Fermez bien chaque tube et retournez-le plusieurs fois pour mélanger. 
  5. Laissez la suspension reposer pendant 5 minutes à température ambiante, puis centrifugez à 1 000 tr/min pendant 10 minutes.
  6. Aspirez le surnageant jusqu'au repère de 1,5 ml sur le tube à centrifuger, en prenant soin d'éviter le culot de cellules.
  7. Tapotez doucement sur le tube à centrifuger pour dissocier le culot.
  8. Effectuez les étapes suivantes trois fois :
    • Ajoutez lentement 10 ml de fixateur de Carnoy dans chaque tube à centrifuger.
    • Fermez bien chaque tube et retournez-le pour mélanger. 
    • Centrifugez la suspension à 1 000 tr/min pendant 10 minutes.
    • Aspirez le surnageant jusqu'au repère de 1,5 ml sur le tube à centrifuger, en prenant soin d'éviter le culot de cellules.
    • Tapotez doucement sur le tube à centrifuger pour dissocier le culot.
  9. Ajoutez lentement le fixateur de Carnoy dans chaque suspension pour produire une suspension légèrement trouble et mélangez doucement.

 

Remarque : vous devez ajouter le fixateur dans le culot de cellules jusqu'à ce que la suspension soit légèrement trouble ; la quantité de fixateur nécessaire dépendra de la taille du culot de cellules. 

 

Les cellules peuvent être conservées à 4 °C dans un tube à centrifuger bien fermé jusqu'à utilisation. Si les lames ne doivent pas être préparées dans les 7 JOURS, portez le volume total à 10 ml et conservez la solution à -20 °C. Répétez deux fois le lavage décrit dans les étapes 8a-8e avant de préparer les lames.

 
 
 
 

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