LSI : Informations essentielles sur le produit

LSI : Informations essentielles sur le produit

 

1. Préparation de la sonde

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  • À température ambiante, mélangez 7 µl de tampon d'hybridation CEP, 1 µl de sonde ADN CEP et 2 µl d'eau (H2O) purifiée.*
  • Centrifugez pendant 1 à 3 secondes, agitez au vortex, puis recentrifugez.
  • Faites chauffer la solution pendant 5 minutes dans un bain-marie à 73 °C.
  • Placez-la sur un chauffe-lames réglé sur 45-50 °C.

 

2. Préparation de la lame

  • Marquez les zones d'hybridation avec un stylo à pointe diamant.vysis-lsi-key-product-information-step-2.gif
  • Immergez la lame dans un bain dénaturant à 73 °C ±1 °C (formamide 70 %/2X SSC) pendant 5 minutes. Si la morphologie des chromosomes métaphasiques pose problème, vous pouvez régler la température du dénaturant sur 70-73 °C pour obtenir de meilleurs résultats.
  • Déshydratez la lame en la plongeant 1 minute dans de l'éthanol à 70 %, puis 1 minute dans de l'éthanol à 85 %, et enfin 1 minute dans de l'éthanol à 100 %.
  • Séchez la lame et placez-la sur un chauffe-lames à 45-50 °C pendant 2 minutes maximum.

 

3. Hybridation

  • Appliquez 10 µl du mélange de sondes sur la lame. Appliquez la lamelle immédiatement après avoir lsi-key-product-information-step-3.gifplacé la sonde sur la lame, puis scellez la lamelle avec de la colle au caoutchouc diluée.
  • Placez la lame dans une chambre humide préchauffée et laissez le processus d'hybridation se poursuivre pendant la nuit, pendant 12 à 16 heures, dans un incubateur à 37 °C.
  • Préparez une cuve de lavage avec une solution 0,4X SSC/0,3 % de NP-40 et placez-la dans un bain-marie à 73 °C ±1 °C pendant au moins 30 minutes. Jetez la solution après 1 jour d'utilisation. Préparez une deuxième cuve contenant une solution 2X SSC/0,1 % de NP-40 à température ambiante.
  • Retirez le joint en colle au caoutchouc et la lamelle et placez-la immédiatement dans une cuve de lavage (0,4X SSC/0,3 % de NP-40), en agitant la lame pendant 1 à 3 secondes. Répétez la procédure pour quatre lames maximum, puis laissez toutes les lames dans le tube de Coplin pendant 2 minutes. Ne retirez pas les lamelles de plusieurs lames avant de placer l'une des lames dans le bain de lavage. Commencez à calculer le temps d'incubation lorsque la dernière lame a été ajoutée au bain de lavage.
  • Lavez la lame dans la solution 2X SSC/0,1 % de NP-40 à température ambiante pendant 5 secondes à 1 minute, en agitant pendant 1 à 3 secondes une fois la lame placée dans le bain.
  • Laissez sécher la lame à l'air dans l'obscurité.

 

 

4. Interprétation

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  • Appliquez 10 µl de contre-colorant DAPI II sur la zone cible de la lame et ajoutez la lamelle.
  • Visualisez la lame avec un ensemble de filtres adapté.

 

 

 

5. Stockage

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  • Conservez la lame à -20 °C dans le noir.
 
 
 
 
Remarques sur la procédure LSI

 

Les fluorophores se décolorent facilement lorsqu'ils sont exposés à la lumière. Pour limiter cette dégradation, manipulez toutes les solutions contenant des fluorophores dans des conditions de faible éclairage, notamment lors des étapes de manipulation des lames hybridées. Réalisez toutes les étapes qui ne nécessitent pas de lumière pour la manipulation (périodes d'incubation, lavages, etc.) dans l'obscurité.

 

L'utilisation d'un thermomètre étalonné est fortement recommandée pour mesurer la température des solutions. 

 

Avant l'ouverture de chaque flacon de réactif, il est recommandé de procéder à une centrifugation pendant 2 à 3 secondes à l'aide d'une microcentrifugeuse de paillasse standard.

 

À température ambiante, placez le tube de Coplin contenant la solution de dénaturation dans un bain-marie à 73 °C environ 30 minutes avant l'utilisation.

 

Si plus de quatre lames ont été hybridées, elles doivent être lavées en plusieurs lots. La température de la solution de lavage doit revenir à 73 °C ±1 °C avant le lavage de chaque lot.

 

 
 
 
 
Préparations LSI des réactifs de travail

 

20X SSC (pour 500 ml de 20X SSC, pH 5,3

Ajoutez 132 g de 20X SSC à 400 ml d'eau (H2O) et mélangez soigneusement. Ajustez le pH à 5,3 à température ambiante avec un pH-mètre en utilisant du chlorure d'hydrogène (HCl) concentré, puis ajustez de façon à obtenir un volume final de 500 ml. Filtrez la solution au moyen d'une unité de filtration avec pores de 0,45 micron. Stockez la solution jusqu'à six mois à température ambiante.

 

2X SSC/0,1 % de NP-40 (pour 1 litre)

Ajoutez 100 ml de 20X SSC (pH 5,3) à 850 ml d'eau (H2O) purifiée. Ajoutez 1,0 ml de NP-40. Ajustez le pH à 7,0 ou 7,5 avec de l'hydroxyde de sodium à l'aide d'un pH-mètre. Ajoutez de l'eau (H2O) de façon à obtenir un volume final de 1 litre. Stockez la solution jusqu'à six mois à température ambiante.  

 

Solution de lavage 0,4X SSC/0,3% de NP-40

Mélangez soigneusement 20 ml de solution 20X SSC avec 950 ml d'eau (H2O) purifiée. Ajoutez 3 ml de NP-40. Mélangez soigneusement jusqu'à la dissolution du NP-40. Ajustez le pH à 7,0 - 7,5 avec de l'hydroxyde de sodium. Ajoutez de l'eau (H2O) purifiée de façon à obtenir un volume final de 1 litre. Stockez la solution à température ambiante. Jetez la solution mère au bout de 6 mois ou si elle paraît trouble ou contaminée.

 

Stockez la solution jusqu'à six mois à température ambiante.



Solution de dénaturation (pour 70 ml)

Ajoutez 49 ml de formamide, 7 ml de 20X SSC (pH 5,3) et 14 ml d'eau (H2O) purifiée dans un tube de Coplin en verre et mélangez soigneusement. Mesurez le pH à température ambiante à l'aide d'un pH-mètre pour vérifier qu'il est compris entre 7,0 et 8,0. Utilisez chaque lot de dénaturant pendant sept jours, puis jetez-le. Entre les périodes d'utilisation, conservez la solution à 4 °C.

 

Solutions de lavage à l'éthanol 

Pour des concentrations finales de 70 %, 85 % et 100 %. Préparez des dilutions d'éthanol à 100 % (v/v) avec de l'eau (H2O). Utilisez la dilution pendant sept jours maximum, puis jetez-la. Si la solution s'évapore ou se dilue, remplacez-la par une nouvelle solution. Entre les périodes d'utilisation, conservez la solution à température ambiante.

 
 
 
 

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