Matériel requis

Le matériel, les réactifs et les équipements suivants sont requis dans le cadre des analyses FISH.

• Éthanol 100 % (EtOH)
• Eau purifiée (distillée ou déionisée)
• HCl 12N (pour ajuster le pH des solutions de lavage)
• NaOH 1N (pour ajuster le pH des solutions de lavage)
• 20X SSC (500 g) (référence de commande Vysis 32-804850)
• NP-40 (référence de commande Vysis 32-804818)
• Tubes de Coplin en verre
• Thermomètre étalonné
• Contre-colorant DAPI I (référence de commande Vysis 30-804830)
• Contre-colorant DAPI II (référence de commande Vysis 30-804831)
• Pinces
• Formamide, qualité ultra-pure (référence de commande Vysis US75828)
• Cylindre gradué de 1 000 ml
• Agitateur magnétique
• Méthanol (pour la préparation des lames)
• Microcentrifugeuse
• Embouts de pipettes pour volumes de 1 à 10 µl
• Pipette de 1 à 10 µl de capacité
• pH-mètre
• Lames de microscope en verre pré-nettoyées
• Eau purifiée
• Minuterie
• Mélangeur vortex
• Bain-marie (37 et 72 °C)

Réactifs de prétraitement

• Kit I de prétraitement à la paraffine (32-801200)
• Kit II de prétraitement à la paraffine (32-801210)
• Kit III de prétraitement à la paraffine (32-801230)

Remarque : lorsque cela est indiqué, mesurez le pH de ces solutions à température ambiante. Sauf indication contraire, utilisez un pH-mètre doté d'une électrode en verre.

Solution 20X SSC

Mélangez soigneusement 132 g de solution 20X SSC dans 400 ml d'eau (H2O) purifiée. Mesurez le pH et ajustez-le à 5,3 avec du chlorure d'hydrogène (HCl). Ajoutez de l'eau (H2O) purifiée de façon à obtenir un volume final de 500 ml. Conservez la solution à température ambiante. Jetez la solution mère au bout de 6 mois, voire plus tôt si elle paraît trouble ou contaminée.

 Solution 2X SSC

Mélangez soigneusement 100 ml de solution 20X SSC (pH = 5,3) dans 850 ml d'eau (H2O) purifiée. Mesurez le pH et ajustez-le à 7,0 ±0,2 avec de l'hydroxyde de sodium (NaOH). Ajoutez de l'eau (H2O) purifiée de façon à obtenir un volume final de 1 litre. Conservez la solution à température ambiante. Jetez la solution mère au bout de 6 mois, voire plus tôt si elle paraît trouble ou contaminée.

Solution de dénaturation (formamide 70 %/2X SSC)

Mélangez soigneusement 49 ml de formamide ultra-pur, 7 ml de solution 20X SSC (pH = 5,3) et 14 ml d'eau (H2O) purifiée dans un tube de Coplin en verre. À l'aide de bandelettes de contrôle du pH, vérifiez que le pH est bien de 7,0-8,0. Entre les périodes d'utilisation, couvrez et conservez la solution à 2-8 °C. Jetez-la au bout de 7 jours.

Solution de lavage 0,4X SSC/0,3 % de NP-40

Mélangez soigneusement 20 ml de solution 20X SSC (pH = 5,3) avec 950 ml d'eau (H2O) purifiée. Ajoutez 3 ml de NP-40. Mélangez soigneusement jusqu'à dissolution complète du détergent NP-40. Mesurez le pH et ajustez-le à 7,0-7,5 avec de l'hydroxyde de sodium (NaOH). Ajoutez de l'eau (H2O) purifiée de façon à obtenir un volume final de 1 litre. Conservez la solution à température ambiante. Jetez la solution mère au bout de 6 mois, voire plus tôt si elle paraît trouble ou contaminée.

Solution de lavage 2X SSC/0,1 % de NP-40

Mélangez soigneusement 100 ml de solution 20X SSC (pH = 5,3) dans 850 ml d'eau (H2O) purifiée. Ajoutez 1 ml de NP-40. Mesurez le pH et ajustez-le à 7,0 ±0,2 avec de l'hydroxyde de sodium (NaOH). Ajoutez de l'eau (H2O) purifiée de façon à obtenir un volume final de 1 litre. Conservez la solution à température ambiante. Jetez la solution mère au bout de 6 mois, voire plus tôt si elle paraît trouble ou contaminée.

Solutions d'éthanol (70 %, 85 %, 100 %)

Préparez des dilutions d'éthanol 100 % (v/v) avec de l'eau (H2O) purifiée. Entre les périodes d'utilisation, couvrez bien et conservez la solution à température ambiante. Jetez les solutions mères au bout de 6 mois.

PBS

Préparez la solution PBS en diluant 20 ml de 10X PBS avec 180 ml d'eau (H2O) purifiée. Conservez la solution à température ambiante. Jetez la solution mère au bout de 6 mois, voire plus tôt si elle paraît trouble ou contaminée.

Solutions de travail et solutions mères de ribonucléase A (RNase)

Préparez une solution mère de 10 mg/ml de RNase A (exempte de DNase) dans une solution 2X SSC. Si l'étiquette de la RNase ne précise pas qu'elle est exempte de DNase, placez la solution de RNase dans un bain d'eau bouillante pendant 10 minutes de façon à inactiver la DNase. Aliquotez en volumes de 10 µl et conservez la solution à -20 °C dans des tubes fermés de 1,0 ml. Au moment de l'emploi, préparez la solution de travail de RNase en laissant décongeler la solution mère de RNase (10 mg/ml) dans le tube et en ajoutant directement 990 µl de 2X SSC de pH 7,0-7,4 aux 10 µl contenus dans le tube. Mélangez au vortex. Évitez de congeler-décongeler la solution. Jetez la solution après usage.

Solutions de travail et solutions mères de pepsine

Préparez une solution mère de pepsine 10 % en mélangeant 0,1 gramme de pepsine dans 1 ml d'eau (préchauffée à 37 °C). Aliquotez en volumes de 35 µl et conservez la solution à -20 °C jusqu'à ce qu'elle soit prête à l'emploi. Lorsqu'elle est prête à l'emploi, préparez une solution de travail de pepsine 0,005 % en mélangeant 35 µl de la solution mère de pepsine 10 % dans la solution de 69,3 ml d'eau purifiée et les 0,7 ml de chlorure d'hydrogène (HCl) 1,0 N chauffés à 37 ºC dans un tube de Coplin (à l'aide d'un bain-marie à 37 °C).

Solution de fixation au formaldéhyde

Mélangez 57,6 ml d'eau purifiée, 3,5 ml de chlorure de magnésium 1M (MgCl2), 7 ml de 10X PBS et 1,89 ml de formaldéhyde à 37 %. Mélangez soigneusement. Placez la solution dans un tube de Coplin. Préparez chaque jour une nouvelle solution.