Moléculaire
Moléculaire

Prétraitement FISH

Le protocole de version courte ne doit pas remplacer la notice d'emballage.

Utilisation

Préparation de cellules fixées sur des lames pour utilisation dans le cadre de l'hybridation in situ en fluorescence (FISH) avec sondes Vysis.

Réactifs fournis

Réactif Quantité Composition Stockage
Tampon à base de pepsine 3 x 50 ml HCl 10 mM 2 à 25 °C
Protéase 3 x 25 mg 2 500 - 3 000 U/mg protéase, lyophilisée -20 à 8 °C
PBS 2 x 250 ml  1X PBS 2 à 25 °C
100X MgCl2 3 x 0,5 ml 2M MgCl2 * 6 H2O 2 à 25 °C
20X SSC 1 x 66 g Chlorure de sodium et citrate de sodium -25 à 30 °C

Réactifs fournis
Matériel requis mais non fourni

  • Éthanol absolu (EtOH)
  • Solution de formol tamponné à 10 %
  • Carnoy (fixateur) (Méthanol : acide acétique glacial [3 pour 1]).
  • Eau purifiée (distillée ou déionisée)
  • Tubes de Coplin
  • Tubes à centrifuger coniques de 15 ml
  • Tubes à microcentrifugation en prolypropylène (1,5 ml)
  • Bain-marie à 37 °C

 

Procédure de prétraitement

  1. Laissez les lames sécher complètement à température ambiante.
  2. Immergez les lames dans une solution 2X SSC pendant 2 minutes à 73 °C ±1 °C
  3. Immergez les lames dans une solution de protéase pendant 10 minutes à 37 °C (assurez-vous que la température du tampon est de 37 °C avant d'ajouter 25 mg [un tube] de protéase.)
  4. Lavez les lames dans une solution 1X PBS pendant 5 minutes à température ambiante.
  5. Fixez les lames dans une solution de formaldéhyde à 1 % pendant 5 minutes à température ambiante. (Mélangez 12,5 ml de formol neutre tamponné à 10 %, 37 ml de solution 1X PBS et 0,5 ml de 100X MgCl2 (un tube).
  6. Lavez les lames dans une solution 1X PBS pendant 5 minutes à température ambiante.
  7. Déshydratez les lames en les immergeant dans une solution à l'éthanol à 70 % à température ambiante. Laissez les lames dans la solution de lavage à l'éthanol pendant 1 minute. Répétez avec de l'éthanol à 85 %, puis de l'éthanol à 100 %.
  8. Suivez le protocole approprié pour la sonde Vysis.
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