Prétraitement FISH

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Utilisation

Préparation de cellules fixées sur des lames pour utilisation dans le cadre de l'hybridation in situ en fluorescence (FISH) avec sondes Vysis.

Réactifs fournis

Réactif Quantité Composition Stockage
Tampon à base de pepsine 3 x 50 ml HCl 10 mM 2 à 25 °C
Protéase 3 x 25 mg 2 500 - 3 000 U/mg protéase, lyophilisée -20 à 8 °C
PBS 2 x 250 ml  1X PBS 2 à 25 °C
100X MgCl2 3 x 0,5 ml 2M MgCl2 * 6 H2O 2 à 25 °C
20X SSC 1 x 66 g Chlorure de sodium et citrate de sodium -25 à 30 °C

Réactifs fournis
Matériel requis mais non fourni

  • Éthanol absolu (EtOH)
  • Solution de formol tamponné à 10 %
  • Carnoy (fixateur) (Méthanol : acide acétique glacial [3 pour 1]).
  • Eau purifiée (distillée ou déionisée)
  • Tubes de Coplin
  • Tubes à centrifuger coniques de 15 ml
  • Tubes à microcentrifugation en prolypropylène (1,5 ml)
  • Bain-marie à 37 °C

 

Procédure de prétraitement

  1. Laissez les lames sécher complètement à température ambiante.
  2. Immergez les lames dans une solution 2X SSC pendant 2 minutes à 73 °C ±1 °C
  3. Immergez les lames dans une solution de protéase pendant 10 minutes à 37 °C (assurez-vous que la température du tampon est de 37 °C avant d'ajouter 25 mg [un tube] de protéase.)
  4. Lavez les lames dans une solution 1X PBS pendant 5 minutes à température ambiante.
  5. Fixez les lames dans une solution de formaldéhyde à 1 % pendant 5 minutes à température ambiante. (Mélangez 12,5 ml de formol neutre tamponné à 10 %, 37 ml de solution 1X PBS et 0,5 ml de 100X MgCl2 (un tube).
  6. Lavez les lames dans une solution 1X PBS pendant 5 minutes à température ambiante.
  7. Déshydratez les lames en les immergeant dans une solution à l'éthanol à 70 % à température ambiante. Laissez les lames dans la solution de lavage à l'éthanol pendant 1 minute. Répétez avec de l'éthanol à 85 %, puis de l'éthanol à 100 %.
  8. Suivez le protocole approprié pour la sonde Vysis.

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