FISH sur noyaux isolés de la paraffine

  • Utile pour les échantillons qui ont été fixés pendant de longues périodes ou pour les échantillons qui sont difficiles à utiliser en tant que cibles pour la méthode FISH, tels que les échantillons de cerveau.
  • Déparaffinez 40 µm de section de tissu avec du xylène (ou Histoclear), 3 x 10 minutes à chaque fois.
  • Déshydratez dans une solution d'éthanol 100 %, 2 x 5 minutes à chaque fois.
  • Incubez dans 4 mg/ml de pepsine (Sigma P-7012, dans du NaCl 0,9 %, pH 1,5), 2 heures à 37 °C. Agitez au vortex toutes les 30 minutes.
  • Filtrez à travers une maille de nylon à 40 µm.
  • Centrifugez à 800 tr/min (dessus de table standard) pendant 5 à 10 minutes.
  • Lavez le culot dans une solution de PBS, centrifugez 2 x 800 tr/min de 5 à 10 minutes à chaque fois.
  • Remettez le culot en suspension dans un volume minimal de PBS.
  • Agitez les noyaux au vortex, étalez-les sur des lames FISHer Superfrost Plus (N° de cat. 12-550-15) puis séchez les lames à 65 °C pendant 10 minutes.
  • Rincez les lames dans la solution de PBS.
  • Incubez dans 0,01 % de Triton 100 dans du PBS pendant 1 minute 30 secondes.
  • Rincez 3 fois dans du PBS, 3 minutes à chaque fois.
  • Incubez 5 minutes dans 0,3 mg/ml de pronase dans 50 mM Tris/Cl pH 7,6, 5 mM EDTA.
  • Incubez dans 2 mg/ml de glycine dans du PBS 3 x 3 minutes à chaque fois.
  • Incubez 5 minutes dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS.
  • Incubez 3 minutes dans 2 mg/ml de glycine dans du PBS.
  • Lavez dans de l'éthanol à 30 %, 60 %, 80 %, 95 % puis 100 %, 3 minutes à chaque fois.
  • Laissez sécher les lames à l'air.
  • Dénaturez simultanément la sonde et l'ADN cible pendant 1 à 3 minutes dans un four à 90 °C.
  • Incubez à 37 °C dans une chambre humide 1 heure au moins ou une nuit maximum.
  • Lavez pendant 1 minute à chaque fois dans les solutions de lavage à 45 °C suivantes : 3 x 50 % formamide/2X SSC, un lavage à chaque fois dans 2X SSC, 2X SSC/0,1 % de NP-40, 2X SSC/0,1 % de NP-40 (RT).
  • Ce protocole nécessite du formamide et du xylène, qui sont des tératogènes. Pour plus d'informations, consultez la fiche technique sur la sécurité des substances.

 

Protocole soumis par :

Dr Rizwan Naaem - Directeur - Laboratoire de cytogénétique

Baystate Medical Center, Springfield, MA 1994

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