Contrôle qualité de la technique FISH en laboratoire

Ces recommandations ont été initialement écrites pour les lames de contrôle ProbeChek™, mais elles représentent un excellent point de départ pour établir des procédures qualité de laboratoire pour l'utilisation des sondes de dénombrement chromosomique CEP® ou LSI®.

Les procédures d'hybridation des sondes CEP ou LSI indiquées dans la notice fournie avec les sondes doivent être suivies. Un microscope à fluorescence parfaitement opérationnel, des filtres et le respect des instructions des notices sont fortement recommandés pour optimiser l'hybridation, et évaluer et interpréter avec précision les signaux des sondes CEP et LSI à l'aide des contrôles ProbeChek™. Les échantillons de test devraient être évalués par microscopie en contraste de phase avant de procéder à l'hybridation, afin de déterminer s'ils sont parfaitement adaptés à la méthode FISH. Les recommandations concernant les lames à traiter avec la méthode FISH sont présentées ci-dessous :

  • Les cellules doivent être réparties uniformément sur la lame. La présence de zones où les cellules sont agglutinées indique une mauvaise préparation de la lame ou une mauvaise préparation de l'échantillon. Il devrait y avoir un minimum de huit cellules par champ 400X (grossissement total). Un plus faible nombre de cellules indique que la concentration cellulaire est trop faible pour un dénombrement optimal. 
  • Les noyaux et les chromosomes en métaphases ne doivent pas être en phase lumineuse. La présence de cellules en phase lumineuse indique que les conditions de préparation des lames n'étaient pas optimales. Optimisez toujours les conditions de préparation des lames à l'aide d'une préparation lymphocytaire de bonne qualité avant de préparer les lames.
  • Il ne devrait pas y avoir de cytoplasme visible autour des noyaux et des métaphases. Le cytoplasme peut empêcher l'hybridation et être à l'origine d'une hybridation inefficace et de résultats inexacts.

Chaque lame hybridée doit être évaluée en fonction des paramètres de qualité déterminés par le laboratoire. En utilisant un microscope, un éclairage et un ensemble de filtres appropriés, la spécificité de l'hybridation, évaluez l'intensité du signal de la sonde et le signal du « bruit » de fond pour déterminer si l'hybridation était optimale pour l'analyse. Au moins 85 % des noyaux présents dans la zone cible doivent pouvoir être dénombrés facilement. Le bruit de fond ou la fluorescence nucléaire de fond doit être minime. Les signaux de la sonde doivent être facilement visibles en utilisant un grossissement minimum de 400X. La majorité des noyaux sur la préparation des lames doivent être dissociés des noyaux environnants et ne doivent pas être couverts par le cytoplasme. La présence de nombreuses zones où les noyaux sont regroupés (plus de 3 noyaux ensemble) peut empêcher la distribution adéquate et homogène des noyaux nécessaire à la précision du dénombrement. Les préparations ne répondant pas à ces critères ne doivent pas être utilisées pour dénombrer les signaux. Le dénombrement des signaux doit être effectué séparément pour chaque sonde évaluée. Cependant, il est possible de dénombrer simultanément les sondes CEP X et Y.

 

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Document suggéré pour la préparation des lames et le contrôle de la qualité de l'hybridation in situ.

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