Notions de microscope et de filtre

Notions de microscope et de filtre

Actuellement en plein développement, la gamme de filtres passe-bande uniques, doubles et triples d'Abbott Molecular offre une visualisation nettement définie et à contraste élevé des réactifs d'Abbott Molecular. En permettant de visualiser simultanément jusqu'à cinq fluorophores différents, les ensembles de filtres multi-passe-bande rehaussent la fonctionnalité des procédures d'hybridation in situ en fluorescence (FISH). Il est ainsi possible d'obtenir plusieurs résultats de façon simultanée, à partir d'une seule analyse. Chaque ensemble de filtres a été conçu et optimisé pour être utilisé avec les fluorophores Abbott Molecular. Les ensembles de filtres Abbott Molecular sont compatibles avec la plupart des modèles de microscope, notamment :

  • Olympus®
  • Zeiss®
  • Leitz/Leica®
  • Nikon® 
Contactez le service technique pour connaître les prix et la disponibilité des filtres compatibles avec votre microscope.
 
 
 
 
Notions de microscopie

Une configuration et un entretien adéquats de votre microscope à fluorescence garantissent l'obtention de résultats optimaux aux tests FISH. Veillez à suivre scrupuleusement les instructions du fabricant concernant le fonctionnement et l'entretien de votre microscope.

 
 
 
 
Lampe d'excitation

La lampe d'excitation est la source de lumière qui excite les fluorophores afin d'émettre un signal fluorescent. Les deux principales caractéristiques d'une source d'excitation sont l'intensité et les spectres d'émission. La lampe doit émettre dans le champ des pics d'absorption des fluorophores donnés afin de provoquer la fluorescence. Plus l'excitation est intense, plus la fluorescence est lumineuse. Toutefois, plus la luminosité est importante, plus la photo-oxydation est rapide, de même que la décoloration des fluorophores. La lampe doit donc être choisie sur la base d'un compromis entre la luminosité de l'image en cours de visualisation et la durée pendant laquelle elle reste visible. Vysis recommande l'utilisation d'une lampe d'excitation au mercure de 100 watts.

 
 
 
 
Hybridation in situ, objectifs recommandés
  • Objectifs plans optimisés pour la microscopie à fluorescence ; grande ouverture numérique (~1,3)
  • Objectifs avec le moins d'éléments optiques Ouverture numérique ≥0,75
  • Objectifs non recommandés avec de nombreux éléments optiques Ouverture numérique ≥0,75

 

 
 
 
 
Ensembles de filtres

Les ensembles de filtres sont conçus pour permettre la visualisation d'un fluorophore spécifique ou d'une combinaison spécifique d'au moins deux fluorophores. Un ensemble de filtres destiné à la microscopie à fluorescence comporte trois éléments : un filtre d'excitation permettant de sélectionner les longueurs d'onde utilisées pour exciter le fluorophore ; un miroir dichroïque (séparateur de faisceau ou polychroïque) permettant de réfléchir la lumière d'excitation sur l'objet présent sur la lame, bloquant une grande partie de la lumière d'excitation réfléchie en retour par la lame en direction de l'oculaire, et laissant passer la lumière émise par le fluorophore dans le cadre de l'hybridation in situ ; et un filtre d'émission final (filtre barrière) laissant passer uniquement la lumière émise par le fluorophore tandis que toutes les autres longueurs d'onde situées en dehors de ce champ sont bloquées.

 
 
 
 
Fluorophore unique

Ensembles de filtres

Les filtres sont classés dans trois grandes catégories : passe-bande, passe-long ou passe-court. Un filtre passe-bande transmet des longueurs d'onde dans une région de longueurs d'onde de « coupure cut-on » à une longueur d'onde faible et de « coupure cut-off » à une longueur d'onde supérieure. Les longueurs d'onde sont bloquées en dessous de la valeur « cut-on » et au-dessus de la valeur « cut-off » par absorption et/ou réflexion. Le passe-bande ou la largeur de bande désigne la largeur maximale en nanomètres (nm) à 50 % de la transmission maximale pour un pic donné. Il peut aussi être appelé FWHM (pleine largeur à mi-hauteur) ou HPBW (largeur de bande à mi-puissance). Un filtre passe-long transmet les longueurs d'onde au-dessus d'une valeur spécifiée et bloque les longueurs d'onde en dessous de cette valeur.

 

Un filtre passe court effectue l'opération inverse et transmet donc les longueurs d'onde en dessous d'une valeur spécifiée, tout en bloquant les longueurs d'onde au-dessus d'une valeur spécifiée. Les filtres interférentiels sont réalisés via le dépôt sous vide de films minces sur un substrat de verre. Ces films minces sont composés d'une alternance de couches de métal ou de diélectrique présentant des indices de réfraction forts et faibles. Les filtres interférentiels peuvent être des filtres passe-bande, passe-long ou passe-court. Les filtres en verre coloré sont conçus à partir de verre imprégné de colorant. Ce sont généralement des filtres passe-long ou passe-bande. Les filtres peuvent contenir plusieurs éléments de type verre coloré et/ou interférence empilés et collés les uns aux autres avec de la résine époxyde de qualité optique (feuilletée). Si un filtre contient des éléments d'interférence, on parle de filtre interférentiel.

 

Les filtres interférentiels sont vivement recommandés en raison de leur largeur de bande étroite, de leur haute efficacité de transmission et de leurs valeurs « cut-off » et « cut-on » extrêmement nettes. Ces filtres sont plus chers, moins durables et présentent généralement un rapport signal/bruit (S/B) supérieur à celui des filtres en verre coloré. Les filtres en verre coloré présentent généralement une plus grande largeur de bande (à savoir 40 nm pour l'excitateur FITC), une efficacité de transmission inférieure et des valeurs « cut-off » et « cut-on » croissantes. Les filtres en verre coloré sont généralement privilégiés pour leur grande disponibilité, leur coût plus abordable et leur plus grande durabilité. 

 

Les filtres d'excitation sont normalement des filtres passe-bande. Les filtres d'excitation peuvent être de type verre coloré ou interférence. Plus la largeur de bande est élevée, plus l'énergie d'excitation l'est également. Au fur et à mesure que la largeur de bande augmente, elle s'accompagne d'une augmentation de l'intensité des émissions, mais également d'un risque supérieur de générer une autofluorescence non spécifique.

 

Les filtres dichroïques sont des filtres interférentiels. Les filtres dichroïques sont fabriqués à l'aide d'une technologie de film mince. Toutefois, comme ils doivent rester fins pour une qualité d'image optimale, ils ne sont pas protégés par du verre feuilleté. Les filtres dichroïques non protégés sont donc davantage exposés aux rayures et aux dégradations. Dans le cas des filtres Zeiss Axioline, l'utilisateur doit prendre des précautions lors du montage des ensembles de filtres. Il ne doit manipuler les filtres dichroïques que par les bords à l'aide de gants.

 

Les filtres d'émission peuvent être des filtres passe-bande ou passe-long.

 

Les filtres d'émission peuvent être de type verre coloré ou interférence. Les filtres passe-long laissent passer le plus de lumière possible, ce qui donne des images plus lumineuses, bien que plus bruyantes, ainsi qu'une diffusion en arrière-plan plus élevée et un rapport signal/bruit (S/B) plus faible. Cette augmentation du bruit et de l'arrière-plan provient des débris cellulaires, de la lame du microscope, etc.

 
 
 
 

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