Lignes directrices en matière de dénombrement

Lignes directrices en matière de dénombrement

Interprétation des résultats

 

Ci-dessous figurent les lignes directrices en matière de dénombrement à l'aide des sondes CEP et LSI dans les noyaux interphasiques. L'utilisateur est encouragé à appliquer ces lignes directrices et à les compléter, si nécessaire, afin d'améliorer la précision, l'exactitude et la reproductibilité du dénombrement en laboratoire. Une technique de numérisation des lames pour le dénombrement par sondes CEP® et LSI® est décrite ci-dessous. Cette technique ou une autre technique, à condition qu'elle soit normalisée dans le laboratoire, peut augmenter l'exactitude et la reproductibilité du dénombrement.

  1. Numérisez la zone cible à l'aide d'un objectif de faible puissance afin d'examiner la distribution des cellules.
  2. Sélectionnez une zone sur la cible où les cellules sont réparties uniformément mais à une densité à laquelle plusieurs noyaux peuvent être évalués dans un champ 400X. Évitez les zones dans lesquelles la distribution des cellules est dense, les noyaux se chevauchent ou les limites nucléaires de chaque noyau ne sont pas définies.
  3. Utilisez un objectif à immersion à huile Plan Apo 40X à 100X et concentrez-vous d'abord sur le quart supérieur gauche du champ de vision sélectionné. Concentrez-vous sur chaque noyau valide dans le premier champ de visualisation et comptez le nombre de signaux d'une couleur de sonde dans les limites nucléaires. Les signaux peuvent avoir une forme ovale compacte et lumineuse, divisée en deux points de petite taille mais reliés, ou une forme diffuse filandreuse. Évaluez les signaux douteux ou divisés en utilisant un grossissement supérieur. Notez le nombre de signaux de chaque cellule. En effectuant un déplacement de gauche à droite (ou de haut en bas), continuez à numériser la lame pour les champs présentant des noyaux évaluables. Lorsque la limite des noyaux visibles ou interprétables est atteinte, passez au champ suivant et poursuivez le processus de numérisation. Répétez ce processus de numérisation jusqu'à ce que le nombre approprié de noyaux soit compté (200 à 500 ou plus selon la prévalence des cellules anormales). Répétez ce processus pour chaque sonde jusqu'à ce que les données soient recueillies pour toutes les sondes de dénombrement.
 
 
 
 
Dénombrement unicolore

Lignes directrices et recommandations concernant le dénombrement à une seule couleur

Il est possible d'effectuer le dénombrement à une seule couleur à l'aide d'un seul filtre passe-bande ou d'un ensemble de filtres passe-bande afin de visualiser la fluorescence après contre-coloration (le cas échéant).

  1. N'évaluez pas les cellules qui se touchent ou qui se chevauchent.
  2. Comptez les signaux diffus s'ils sont distincts des autres signaux.
  3. Comptez les signaux divisés (deux petits signaux très proches) comme un signal. Les deux signaux représentent un complément chromosomique unique.
  4. Comptez deux signaux reliés par un brin de fluorescence comme un signal.
  5. Ne comptez pas les cellules sans signal, sauf si elles sont entourées de noyaux contenant des signaux.
  6. N'évaluez pas les noyaux qui ne sont pas intacts.
  7. N'évaluez pas les noyaux dont des signaux de différentes couleurs se chevauchent.
  8. Ne comptez pas les signaux d'hybridation non spécifiques. Ces signaux peuvent être reconnus par leur plus faible intensité et leur forme différente.
  9. N'évaluez pas les noyaux dont les signaux se trouvent à leur périphérie.
  10. Comptez seulement les noyaux dans lesquels un dénombrement définitif peut être effectué ; ignorez tous les autres.
  11. Notez les valeurs exactes. Comptez à nouveau les signaux afin de confirmer les dénombrements douteux.
fish-lab-quality-control-guidelines-for-single-color-enumeration.gif

 

 
 
 
 
Dénombrement bicolore

Au moins deux sondes marquées avec des fluorophores de couleur différente qui sont hybridées sur les mêmes cellules peuvent être dénombrées séparément à l'aide d'ensembles de filtres passe-bande uniques ou simultanément à l'aide d'ensembles de filtres passe-bande multiples en fonction de l'intensité du signal des sondes et de la taille du noyau. Les cellules possédant de petits noyaux ou des noyaux limités peuvent être difficiles à dénombrer à l'aide d'ensembles de filtres passe-bande multiples en raison de la disposition spatiale du signal de sonde dans le noyau ou de la perception de signaux de sonde faibles.

  1. N'évaluez pas les cellules qui se touchent ou qui se chevauchent.
  2. Comptez les signaux diffus s'ils sont distincts des autres signaux.
  3. Comptez les signaux divisés (deux petits signaux très proches) comme un signal. Les deux signaux représentent un complément chromosomique unique.
  4. Comptez deux signaux reliés par un brin de fluorescence comme un signal.
  5. Ne comptez pas les cellules sans signal, sauf si elles sont entourées de noyaux contenant des signaux.
  6. N'évaluez pas les noyaux qui ne sont pas intacts.
  7. N'évaluez pas les noyaux dont des signaux de différentes couleurs se chevauchent.
  8. Ne comptez pas les signaux d'hybridation non spécifiques. Ces signaux peuvent être reconnus par leur plus faible intensité et leur forme différente.
  9. N'évaluez pas les noyaux dont les signaux se trouvent à leur périphérie.
  10. Comptez seulement les noyaux dans lesquels un dénombrement définitif peut être effectué ; ignorez tous les autres.
  11. Notez les valeurs exactes. Comptez à nouveau les signaux afin de confirmer les dénombrements douteux.
 
 
 
 

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