CGH avec cassures-déplacement (Nick Translation) : Préparation des réactifs

CGH avec cassures-déplacement (Nick Translation) : Préparation des réactifs

 

0,2 mM de dUTP SpectrumGreen ou SpectrumRed

Ajoutez 10 µl de dUTP 1 mM à 40 µl d'eau exempte de nucléase.

 

dTTP 0,1 mM

Ajoutez 10 µl de dTTP 0,3 mM à 20 µl d'eau exempte de nucléase.

 

Mélange dNTP 0,1 mM

Mélangez 10 µl de dATP 0,3 mM, 10 µl de dCTP 0,3 mM et 10 µl de dGTP 0,3 mM.

 

Extrait d'ADN génomique

Préparez une solution d'extrait d'ADN de 0,2 µg/µl à 1 µg/µl dans un tampon Tris-EDTA (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,5).

 
 
 
 
CGH avec cassures-déplacement (Nick Translation) : Procédure d'analyse

 

Cette procédure effectue le marquage d'environ 1 µg d'extrait d'ADN génomique. C'est assez pour cinq hybridations génomiques comparatives.

  1. Placez un tube à microcentrifugation sur la glace et laissez-le refroidir.
  2. Ajoutez les composants suivants dans le tube dans l'ordre indiqué :
    cgh-nick-translation-assay-procedure.gif
  3. Agitez brièvement le tube au vortex.
  4. Incubez pendant 2 à 4 heures à 15 °C.
  5. Arrêtez la réaction en chauffant le tube au bain-marie à 70 °C pendant 10 minutes.
  6. Refroidissez le tube sur de la glace. 

Détermination de la taille de la sonde

La détermination de la taille de la sonde est une partie essentielle de la procédure d'hybridation génomique comparative. Pour obtenir des instructions détaillées sur la préparation et la migration d'un gel d'agarose consultez (1) Maniatis T, Fritsch EF et Sambrook J. Gel electrophoresis of DNA (électrophorèse sur gel de l'ADN). Dans : Molecular cloning : a laboratory manual (Clonage moléculaire : un manuel de laboratoire). 2 ème édition Cold Spring, NY : Cold Spring Harbor Laboratory; 1989 ou (2) Ausubel FM, ed. Preparation and Analysis of DNA. Dans : Current Protocols in Molecular Biology (Protocoles actuels en biologie moléculaire). New York : Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, 1989.

  1. Préparez un gel d'agarose 1 % en ajoutant 1 g d'agarose à 100 ml de tampon TAE. Chauffez la solution au micro-ondes jusqu'à ce que l'agarose soit fondu. Ce volume est suffisant pour trois minigels.
  2. Laissez la solution d'agarose refroidir à 55 °C et ajoutez 10 µl d'EtBr (concentration finale de 0,01 % (v/v)).
  3. Versez l'agarose fondu dans un appareil à minigel (10 cm x 6,5 cm) avec peignes. Laissez l'agarose refroidir pour qu'il se solidifie.
  4. Versez assez de tampon TAE dans l'appareil à minigel pour recouvrir le gel d'environ 1 mm.
  5. Déposez 9 µl du mélange de réaction contenant l'ADN ayant subi la réaction de cassures-déplacement (nick translation), puis ajoutez 1 µl de tampon de chargement de gel.
  6. Analysez l'échantillon ayant subi la réaction de cassures-déplacement sur une ligne et un échantillon du marqueur de la taille de l'ADN sur une autre ligne pour mesurer la taille de la sonde.
  7. Passez le gel à l'électrophorèse à 10 V/cm jusqu'à ce que la coloration dans le tampon de chargement de gel soit à 2 - 3 cm de la fin du gel.
  8. Estimez la fourchette de taille de la sonde à partir du gel. La majorité du frottis d'ADN doit mesurer entre 300 et 3 000 paires de base. Les fragments de sonde plus grands produiront une intensité de fluorescence plus faible lorsqu'ils seront utilisés avec l'analyse d'hybridation génomique comparative. 

En augmentant la quantité d'enzymes et le temps d'incubation, la répartition en fonction de la taille se fait entre les fragments de sonde de plus en plus petits. Pour produire des fragments de sonde plus petits, appliquez les conditions suivantes, énumérées par ordre décroissant de taille du fragment : 5 µl d'un mélange d'enzymes/2 heures d'incubation, 5 µl d'un mélange d'enzymes/4 heures d'incubation, 10 µl d'un mélange d'enzymes/2 heures d'incubation et 10 µl d'un mélange d'enzymes/4 heures d'incubation. Ajustez la quantité d'eau exempte de nucléase ajoutée pour conserver le volume total de réaction à 50 µl.

 
 
 
 

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