Hybridation génomique comparative (CGH) : Préparation des réactifs

Hybridation génomique comparative (CGH) : Préparation des réactifs

20X SSC, pH 5,3

Mélangez soigneusement 66 g de solution 20X SSC dans 200 ml d'eau (H2O) purifiée. Ajustez le pH à 5,3 à température ambiante en utilisant du HCl concentré pour obtenir un volume final de 250 ml. Conservez la solution à température ambiante. Jetez la solution mère au bout de 6 mois, voire plus tôt si elle paraît trouble ou contaminée.

 

Solution de dénaturation

Ajoutez 49 ml de la formamide, 7 ml de 20X SSC (pH 5,3) et 14 ml d'eau purifiée au tube de Coplin en verre et mélangez soigneusement. Vérifiez que le pH est compris entre 7,0 et 7,5 en mesurant le pH à température ambiante. Entre les périodes d'utilisation, couvrez et conservez la solution à 4 °C. Jetez après 7 jours d'utilisation.

 

Solutions de lavage à l'éthanol (70 %, 85 % et 100 %)

Diluez l'éthanol à 100 % (v/v) avec de l'eau purifiée pour préparer les solutions de lavage. Entre les périodes d'utilisation, couvrez et conservez la solution à température ambiante. Jetez les solutions mères au bout de 6 mois.

 

Solution de lavage 0,4X SSC/0,3 % de NP-40

Mélangez soigneusement 20 ml de solution 20X SSC avec 950 ml d'eau (H2O) purifiée. Ajoutez 3 ml de NP-40. Mélangez soigneusement jusqu'à la dissolution du NP-40. Ajustez le pH à 7,0 - 7,5 avec de l'hydroxyde de sodium. Ajoutez de l'eau (H2O) purifiée de façon à obtenir un volume final de 1 litre. Stockez la solution à température ambiante. Jetez la solution mère au bout de 6 mois ou si elle paraît trouble ou contaminée.

 

Solution de lavage 2X SSC/0,1 % de NP-40

Ajoutez 1 ml de NP-40. Ajustez le pH à 7,0 - 7,5 avec de l'hydroxyde de sodium. Ajoutez de l'eau (H2O) purifiée de façon à obtenir un volume final de 1 litre. Stockez la solution à température ambiante. Jetez la solution mère au bout de 6 mois ou si elle paraît trouble ou contaminée.

 

ADN de test

Marquez directement l'ADN de test (et le contrôle non marqué) avec du dUTP SpectrumGreenTM. Suivez la procédure indiquée dans le kit Vysis cassures-déplacement CGH (CGH Nick Translation Kit).

 
 
 
 
Procédures de CGH

Contrôles 

Les contrôles positifs et négatifs fournissent des comparaisons pour l'évaluation de l'hybridation et l'interprétation des données CGH. Pour un contrôle négatif, utilisez un ADN normal pour l'ADN de test et l'ADN de référence (N° de cat. 32-804024, 32-802024). Les profils d'intensité pour cette expérience doivent correspondre à la plage de valeurs de seuil déterminées par l'analyse d'image. Pour un contrôle positif, utilisez l'ADN de test (N° de cat. 32-800227) qui est extrait d'une ligne de cellules avec des aberrations génétiques connues qui sont faciles à détecter par l'analyse CGH.

 

Lames avec métaphase normale cible pour l'analyse CGH

Ne pré-traitez pas les lames. Les lames sont préparées en utilisant des méthodes de préparation des lames cytogénétiques standard qui sont optimisées pour l'analyse CGH. Les lames sont fabriquées à partir de lymphocytes stimulés par la phytohémagglutinine (PHA) mis en culture pendant 48 à 72 heures avant l'ajout de la thymidine pour synchroniser les cellules. La longueur du chromosome est de 400 à 550 bandes. Les lymphocytes sont issus d'un donneur mâle au caryotype normal.

 

Préparation du mélange de sondes

Pour produire une hybridation avec des intensités de signal équivalentes pour l'ADN marqué par SpectrumGreenTM et pour l'ADN marqué par SpectrumRedTM, la quantité d'ADN marqué par SpectrumGreen est augmentée.

  1. Combinez les éléments suivants dans un tube à microcentrifugation de 1,5 ml :
    10 µl (200 ng) d'ADN test (marqué par réaction de cassures-déplacement) SpectrumGreen 1 µl (100 ng) d'ADN génomique total de référence SpectrumRed (N° de cat. 32-804023 ou 32-804024) 10 µl (10 µg) d'ADN humain COT-1-1 (N° de cat. 32-800028)
  2. Ajoutez 1 µl (0,1 volume) d'acétate de sodium 3 M, puis 52,5 µl (2,5 volumes) d'éthanol 100 % pour précipiter l'ADN. Passez brièvement le tube sur un agitateur vortex puis placez-le sur de la glace sèche pendant 15 minutes.
  3. Centrifugez à 12 000 tr/min pendant 30 minutes à 4 °C pour culotter l'ADN. 
  4. Retirez le surnageant et séchez sous vide le culot pendant 10 à 15 minutes à température ambiante.
  5. Remettez le culot en suspension dans 3 µl d'eau purifiée et 7 µl de tampon d'hybridation CGH. Dénaturez la sonde en chauffant le mélange de sondes au bain-marie pendant 5 minutes à 73 °C. REMARQUE : dénaturez la sonde pendant la déshydratation de la lame (étape 3 de l'hybridation de la sonde sur la métaphase cible).

Hybridation de la sonde sur la métaphase cible 

  1. Marquez les zones d'hybridation sur la lame à l'aide d'un stylo à pointe diamant.
  2. Assurez-vous que la température de la solution de dénaturation est de 73 °C ±1 °C. Immergez la lame dans la solution contenant des étalements de métaphase normale pendant 5 minutes.
  3. Déshydratez la lame en la plongeant 1 minute dans de l'éthanol à 70 %, puis 1 minute dans de l'éthanol à 85 %, et enfin 1 minute dans de l'éthanol à 100 %.
  4. Séchez la lame en plaçant son bord inférieur sur un buvard et en essuyant sa face inférieure avec une serviette en papier.
  5. Placez la lame sur un chauffe-lames à 45-50 °C pour permettre l'évaporation de l'éthanol restant.
  6. Appliquez 10 µl du mélange de sondes dénaturées sur la lame. 
  7. Déposez immédiatement la lamelle et scellez avec de la colle au caoutchouc diluée.
  8. Placez la lame dans une chambre scellée et humide, puis la boîte dans un incubateur à 37 °C pendant 48 à 72 heures pour permettre l'hybridation.

Lavage des lames 

  1. Avant toute utilisation, chauffez au bain-marie la cuve de lavage contenant la solution de lavage 0,4X SSC/0,3 % de NP-40 à 74 °C ±1 °C pendant au moins 30 minutes. Jetez après 1 jour d'utilisation. Préparez une deuxième cuve de lavage contenant une solution 2X SSC/0,1 % de NP-40 à température ambiante.
  2. Retirez le joint en colle au caoutchouc et la lamelle et chauffez immédiatement au bain-marie la lame dans la solution de lavage 0,4X SSC/0,3 % de NP-40 à 74 °C ±1 °C. Agitez la sonde pendant 1 à 3 secondes.
  3. Répétez l'étape 2 pour chaque lame (ne lavez pas plus de quatre lames à la fois), puis laissez les lames sur leur support pendant 2 minutes.
  4. Placez la lame dans la solution de lavage 2X SSC/0,1 % de NP-40 à température ambiante. Agitez la lame pendant 1 à 3 secondes puis laissez-la sur son support pendant 5 secondes à 1 minute.
  5.  Laissez sécher la lame à l'air dans l'obscurité.

Visualisation de l'hybridation

Appliquez 10 µl de contre-colorant DAPI II et une lamelle sur chaque zone d'hybridation.

 

 
 
 
 

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