CEP : Informations essentielles sur le produit

CEP : Informations essentielles sur le produit

 

1. Préparation de la sonde

  • À température ambiante, mélangez 7 µl de tampon d'hybridation CEP, 1 µl de sonde ADN CEP et 2 µl d'eau (H2O) purifiée.*vysis-products-cep-protocol-1.gif
  • Centrifugez pendant 1 à 3 secondes, agitez au vortex, puis recentrifugez.
  • Chauffez au bain-marie à 73 °C pendant 5 minutes, puis placez sur un chauffe-lames réglé à 45-50 °C.

*Pour l'hybridation simultanée de deux sondes CEP, mélangez à la place 7 µl de tampon d'hybridation CEP, 1 µl d'eau purifiée et 1 µl de chacune des deux sondes ADN CEP.

 

2. Préparation des lames

  • Marquez les zones d'hybridation avec un stylo à pointe diamant. vysis-products-cep-protocol-2.gif
  • Immergez la lame dans un bain dénaturant à 73 °C +/-1 °C (Formamide 70 %/2X SSC) pendant 5 minutes.
  • Déshydratez la lame en la plongeant 1 minute dans de l'éthanol à 70 %, puis 1 minute dans de l'éthanol à 85 %, et enfin 1 minute dans de l'éthanol à 100 %.
  • Séchez la lame et placez-la sur un chauffe-lames à 45-50 °C pendant 2 minutes.

 

3. Hybridation

  • Appliquez 10 µl du mélange de sondes sur la lame. Appliquez la lamelle dès que la sonde est vysis-products-cep-protocol-3.gifdéposée sur la lame. (La lame n'a pas besoin d'être scellée pour des hybridations courtes).
  • Placez la lame dans une chambre préchauffée et non humide et laissez faire le processus d'hybridation pendant au moins 30 minutes (sans dépasser 60 minutes) dans un incubateur à 42 °C.
  • Préparez une cuve de lavage avec une solution 0,4X SSC/0,3 % de NP-40 et placez-la dans un bain-marie à 73 °C ±1 °C pendant au moins 30 minutes. Jetez la solution après 1 jour d'utilisation. Préparez une deuxième cuve contenant une solution 2X SSC/0,1 % de NP-40 à température ambiante.
  • Retirez la lamelle et placez-la immédiatement dans une cuve de lavage 0,4X SSC/0,3 % de NP-40, en agitant la lame pendant 1 à 3 secondes. Répétez la procédure pour les trois autres lames puis laissez les quatre lames dans le tube de Coplin pendant 2 minutes.
  • Lavez les lames dans la solution 2X SSC/0,1 % de NP-40 à température ambiante pendant 5 secondes à 1 minute, en agitant pendant 1 à 3 secondes lorsque la lame est placée dans le bain.
  • Laissez sécher la lame à l'air dans l'obscurité.

 

4. Interprétation

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  • Appliquez 10 µl de contre-colorant DAPI II sur la zone cible de la lame et ajoutez la lamelle.
  • Visualisez la lame avec un ensemble de filtres adapté.

 

 

5. Stockage vysis-products-cep-protocol-5.gif

  • Conservez la lame à -20 °C dans le noir. 
 
 
 
 
Remarques sur la procédure CEP

 

Les fluorophores se décolorent facilement lorsqu'ils sont exposés à la lumière. Pour limiter cette dégradation, manipulez toutes les solutions contenant des fluorophores dans des conditions de faible éclairage, notamment lors des étapes de manipulation des lames hybridées. Réalisez toutes les étapes qui ne nécessitent pas de lumière pour la manipulation (périodes d'incubation, lavages, etc.) dans l'obscurité. 

 

L'utilisation d'un thermomètre étalonné est fortement recommandée pour mesurer la température des solutions. 

 

Avant toute première ouverture de chaque flacon de réactif, centrifugez pendant 2 à 3 secondes à l'aide d'une microcentrifugeuse de paillasse standard. 

 

Chauffez le tube de Coplin à température ambiante contenant la solution dénaturante au bain-marie à 73 °C +/-1 °C pendant environ 30 minutes avant de l'utiliser. 

 

Si plus de quatre lames ont été hybridées, elles doivent être lavées en plusieurs lots. La température de la solution de lavage doit revenir à 73 °C +/-1 °C entre chaque lavage de lot.

 

 
 
 
 
Sonde CEP : préparations des réactifs de travail

 

20X SSC (pour 500 ml de 20X SSC, pH 5,3) 

Ajoutez 132 g de 20X SSC à 400 ml d'eau (H2O) et mélangez soigneusement. Ajustez le pH à 5,3 à température ambiante avec un pH-mètre en utilisant du chlorure d'hydrogène (HCl) concentré, puis ajustez de façon à obtenir un volume final de 500 ml. Filtrez la solution au moyen d'une unité de filtration avec pores de 0,45 micron. Stockez la solution jusqu'à six mois à température ambiante.

 

2X SSC/0,1 % de NP-40 (pour 1 litre)

Ajoutez 100 ml de 20X SSC (pH 5,3) à 850 ml d'eau (H2O) purifiée. Ajoutez 1,0 ml de NP-40. Ajustez le pH à 7,0 ou 7,5 avec de l'hydroxyde de sodium à l'aide d'un pH-mètre. Ajoutez de l'eau (H2O) de façon à obtenir un volume final de 1 litre. Stockez la solution jusqu'à six mois à température ambiante.  

 

Solution de lavage 0,4X SSC/0,37 % de NP-40 

Ajoutez de l'eau (H2O) de façon à obtenir un volume final de 1 litre. Filtrez la solution au moyen d'une unité de filtration avec pores de 0,45 micron. Stockez la solution jusqu'à six mois à température ambiante. Remarque : la température de la solution de lavage doit être de 73 °C +/-1 °C avant utilisation. Afin de maintenir la bonne température, quatre lames DOIVENT être placées en même temps dans la solution chauffée. Si moins de quatre lames ont été hybridées, utilisez des lames de microscope à température ambiante pour porter le nombre de lames à quatre. Si plus de quatre lames ont été hybridées, elles doivent être lavées en plusieurs lots. La température de la solution de lavage doit revenir à 73 °C +/-1 °C entre chaque lavage de lot. Ne retirez pas les lamelles de plusieurs lames avant d'avoir placé l'une des lames dans le bain de lavage. Commencez à calculer le temps d'incubation lorsque la dernière lame a été ajoutée au bain de lavage.

 

Solution de dénaturation (pour 70 ml) 

Ajoutez 49 ml de la formamide, 7 ml de 20X SSC (pH 5,3) et 14 ml d'eau purifiée au tube de Coplin en verre et mélangez soigneusement. Mesurez le pH à température ambiante à l'aide d'un pH-mètre pour vérifier qu'il est compris entre 7,0 et 8,0. Utilisez chaque lot de dénaturant pendant sept jours, puis jetez-le. Entre chaque période d'utilisation, conservez à 4 °C.

 

Solutions de lavage à l'éthanol 

Pour des concentrations finales de 70 %, 85 % et 100 %. Préparez des dilutions d'éthanol à 100 % (v/v) avec de l'eau. Utilisez la dilution pendant sept jours puis jetez-la. Si la solution s'évapore ou se dilue, remplacez-la par une nouvelle solution. Entre les périodes d'utilisation, conservez la solution à température ambiante.

 
 
 
 

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